小鼠原核期胚胎玻璃化冷凍保存.pdf

1、為了建立昆明小鼠胚胎冷凍經(jīng)濟、有效、穩(wěn)定的方案，本研究以該品系小鼠體內(nèi)受精胚胎（原核胚）為試驗材料，從胚胎回收、冷凍載體、冷凍保護劑等環(huán)節(jié)出發(fā)，探討了昆明小鼠體內(nèi)受精原核期胚胎經(jīng)歷玻璃化冷凍保存后的發(fā)育能力。
　　 論文包括五個試驗，具體研究結(jié)果如下：（1）研究了體重、激素注射量對昆明小鼠超排效果的影響。結(jié)果顯示：①體重<20g時，供體小鼠的超排效率顯著低于體重在20～31g的昆明小鼠（P<0.05）；②使用5IU PMSG/h

2、CG，超排效率不如10IU PMSG/hCG。
　　 （2）研究了開放式拉長細管法（Open pulled straws，OPS）與冷凍帽（Cryotop）兩種載體對小鼠原核期胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：OPS組和Cryotop組解凍后胚胎的2-細胞率、4-細胞率和囊胚率分別為84.28％ vs74.10％、57.35％ vs65.87％、28.34％ vs43.57％與對照組（81.19％、64.25％、40.04％）差異不顯著

3、（P>0.05），但Cryotop冷凍結(jié)果更接近對照組，效果較佳。
　　 （3）研究了Cryotop與自制Cryotip載體對小鼠原核期胚胎發(fā)育效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們自制的Cryotip玻璃化冷凍載體與成品載體冷凍解凍昆明小鼠原核期胚胎，經(jīng)體外培養(yǎng)，胚胎2-細胞率、4-細胞率、桑椹胚率和囊胚率差異都不顯著（P>0.05），但從數(shù)值上看，在自制Cryotip載體冷凍結(jié)果中，除了2-細胞發(fā)育率外，其他幾項結(jié)果都稍微高于成品組：桑椹

4、胚與囊胚率分別為63.84％、58.48％（自制Cryotip組為66.29％、62.72％）?？梢?，自制載體冷凍效果不比成品冷凍效果差。
　　 （4）研究了不同冷凍保護劑：15％ EG+15％ DMSO+蔗糖（EDS）與15％EG+15％ PROH+蔗糖（EPS）對小鼠原核期胚胎發(fā)育效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①采用EPS與EDS兩種保護劑所獲得的胚胎回收率與存活率96.35％、84.83％（94.95％、95.83％）無顯著差異（

5、P>0.05）；②冷凍解凍后胚胎2-細胞發(fā)育率60％、70％與對照組（92.50％）差異顯著（P<0.05），但冷凍組間無差異（P>0.05）；③在囊胚發(fā)育率中，采用EDS組與對照組無顯著差異（56.35％ vs76.90％）（P>0.05），但EPS組與對照組（33.84％ vs76.90％）以及冷凍組之間（33.84％ vs56.35％）差異顯著（P<0.05）；④EDS組囊胚平均細胞數(shù)與EPS、對照組相比較差異顯著（P<0.05）

6、。結(jié)果可見采用EDS作冷凍保護劑對昆明小鼠原核期胚胎冷凍效果好于EPS方法。
　　 （5）除了滲透性冷凍保護劑對冷凍效果有影響，滲透性保護劑與有很大的作用，本試驗以EG、DMSO為滲透性保護劑，研究了蔗糖與海藻糖對胚胎冷凍效果的影響，以及不同的胚胎體外培養(yǎng)密度：5枚/10μl、10枚/40μl、5枚/40μl（即構(gòu)成1：2、1：4、1：8密度大?。ε咛グl(fā)育的影響。結(jié)果顯示采用蔗糖與海藻糖兩種保護劑所獲得的胚胎2-細胞率、4-細

7、胞率、桑椹胚率與囊胚率（70％ vs67.5％；69.04％ vs72.44％；57.22％ vs58.75％；54.05％ vs53.83％）上均無顯著差異（P>0.05），而且數(shù)值差別非常的小，說明蔗糖與海藻糖都能很好地作為昆明小鼠原核期胚胎冷凍保護劑，而且效果好；解凍后胚胎在1：2、1：4、1：8密度大小的KSOM-AA培養(yǎng)液中培養(yǎng)所獲得的胚胎2-細胞率、4-細胞率、桑椹胚率以及囊胚率無顯著差異（P>0.05）。
　　 綜