蝎毒多肽提取物對前列腺癌侵襲性的影響.pdf

1、背景前列腺癌(prostatecancer，PCa)是常見的泌尿系惡性腫瘤。在我國，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化及人口平均壽命的延長，有逐年升高的趨勢。PCa易發(fā)生轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已有轉(zhuǎn)移，超過90％會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，臨床尚無有效治療方法。因此，針對高發(fā)骨轉(zhuǎn)移，確立有效的抑制轉(zhuǎn)移治療靶向，尋找一種有效抑制其轉(zhuǎn)移的藥物具有重要意義。腫瘤細(xì)胞的特性之一是細(xì)胞周期異常，使腫瘤無限制地增殖。腫瘤治療的中心環(huán)節(jié)是干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而使腫瘤細(xì)胞

2、增殖速率減慢或誘導(dǎo)細(xì)胞走向程序性死亡(或凋亡)。侵襲主要是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，穿透細(xì)胞外基質(zhì)及血管基底膜，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的過程。粘附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)在此過程中起著重要作用。E-鈣粘蛋白主要介導(dǎo)同源細(xì)胞粘附，基質(zhì)金屬蛋白酶-9降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，兩者在前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著重要作用。 東亞鉗蝎是蝎類的一種，在我國分布較廣，具有熄風(fēng)解痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛

3、的功效。近年來的研究已經(jīng)證明，全蝎及其提取物對多種腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，對一些移植性腫瘤也有顯著的抑制和預(yù)防作用。我們從東亞鉗蝎蝎毒中提取了分子量在6000～7000，由50～60個氨基酸組成的多肽成分，命名為蝎毒多肽提取物(polypeptideextractfromscorpionvenom，PESV)。本研究組前期實驗結(jié)果表明，PESV不僅對前列腺癌細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用，而且還可抑制腫瘤血管生成，提高荷瘤機(jī)體免疫功能，但其抗腫瘤

4、的確切機(jī)制尚未全面闡明。本實驗旨在研究PESV對前列腺癌細(xì)胞增殖及侵襲性的影響，進(jìn)一步揭示其抗腫瘤的作用機(jī)制。 目的：研究PESV對前列腺癌DU-145細(xì)胞增殖及侵襲的影響及可能作用機(jī)制，為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療提供實驗依據(jù)。 方法：培養(yǎng)人前列腺癌DU-145細(xì)胞系，MTT比色法檢測各組前列腺癌細(xì)胞的吸光度值，并計算細(xì)胞生長抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，免疫組化檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白；選擇PESV對DU-145細(xì)胞的無毒劑

5、量(20μg/mL)，應(yīng)用體外侵襲模型Transwell小室法檢測PESV對DU-145細(xì)胞侵襲能力的影響；應(yīng)用免疫組化SP法檢測PESV對DU-145細(xì)胞MMP-9、TIMP-1、E-Cadherins的蛋白表達(dá)水平影響；RT-PCR檢測對MMP-9、TIMP-1的mRNA表達(dá)水平影響。 結(jié)果： 1.PESV對DU-145細(xì)胞生長的影響：以不同濃度的PESV分別作用于DU-145細(xì)胞24h后，結(jié)果顯示：PESV＜20μ

6、g/mL時，DU-145細(xì)胞的IR＜10.4％，對細(xì)胞的生長抑制作用不明顯；PESV＞40μg/mL時，DU-145細(xì)胞的IR＞30.5％，對細(xì)胞的生長具有明顯抑制作用(同對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均為0.000)，PESV呈劑量依賴性抑制DU-145細(xì)胞的增殖(實驗組各濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，PESV干預(yù)后處于S期的細(xì)胞減少，處于G0/G1和G2/M期的細(xì)胞增多;PESV(濃度為40μg/ml)

7、干預(yù)后，DU-145細(xì)胞cyclinE蛋白表達(dá)水平下調(diào)，p27蛋白表達(dá)水平上調(diào)，與對照組相比，差異顯著(P＜0.01)。 2.PESV對DU-145細(xì)胞侵襲能力的影響：采用transwell小室法，經(jīng)不同濃度的PESV作用后，100倍倒置顯微鏡下計數(shù)濾膜背面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明對照組每100倍視野穿過的細(xì)胞數(shù)平均為(51.29±7.56)，而5、10和20μg/mL濃度的PESV作用后，每100倍視野穿過的細(xì)胞數(shù)分別平均為(20.

8、43±1.51)、(12.29±2.75)和(5±1.73)，不同濃度組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.933，P=0.000)，各濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均為0.000)。表明隨著PESV濃度的增加，其抑制DU-145細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力越強(qiáng)。 3.PESV對DU-145細(xì)胞MMP-9、TIMP-1和E-Cadherins表達(dá)的影響：免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，MMP-9、TIMP-1和E-Cadherins陽性表

9、達(dá)信號均定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淡棕黃色至棕黃色著色，PESV處理組前列腺癌細(xì)胞中MMP-9表達(dá)明顯降低，TIMP-1表達(dá)增高，E-Cadherins表達(dá)增高。RT-PCR結(jié)果表明，PESV處理組前列腺癌細(xì)胞中MMP-9mRNA水平明顯降低，TIMP-1mRNA水平升高。 結(jié)論： 1.PESV濃度在40μg/ml～100μg/ml對激素非依賴性前列腺癌DU-145細(xì)胞生長和增殖具有抑制作用。其可能作用機(jī)制為p27蛋白表達(dá)水平上調(diào)

10、，cyclinE蛋白下調(diào)，使癌細(xì)胞停滯在G0/G1期。 2.DU-145細(xì)胞可表達(dá)MMP-9、TIMP-1及E-Cadherins蛋白，定位于細(xì)胞漿；PESV可以抑制前列腺癌細(xì)胞MMP-9的分泌，增加MMP-9內(nèi)源性抑制劑TIMP-1的分泌，增強(qiáng)E-Cadherins蛋白的表達(dá)，從而增加前列腺癌DU-145細(xì)胞之間的粘附性，抑制其降解周圍細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜。推斷PESV可能通過影響MMP-9/TIMP-1及粘附因子E-Cadhe