NEK2與前列腺癌侵襲性和預后的相關研究.pdf

1、博士學位論文N E K 2 與前列腺癌侵襲性和預后的相關研究博士研究生：曾彥茹指導教師：摘要研究背景和目的：中心體是人類細胞的微管組織中心，在有絲分裂紡錘體的形成和染色體分‘ 一————————————；。———————————’離起到關鍵作用。有研究顯示各種各樣組織來源的癌細胞通常表現(xiàn)出與中心體————，—一一 數(shù)目或結構相關的多極紡錘體。而一些位于中! 業(yè)觸細胞周期調繭蛋白邀酶，是直絲坌裂進程和形成正確雙極紡錘體所必需的。目前公認的

2、蟲! 墜生擔苤邀酶是N E K 2 ，它有兩種剪接變體．盟E K 2 A 一和N E K 2 B 。它們的表達調控細胞周期。 ——_ _ _ ——- ——一————一一一一～一N E K 2 是活性的絲氨酸和蘇氨酸激酶，磷酸化多種參與中心體復制和細胞周期調控蛋白質。其結合微管，在中心體含量豐富，有助于中心體在細胞周期的G 2 ／M 期分裂。異常N E K 2 活動因未能調節(jié)中心體復制，從而導致非整倍體，這些都是腫瘤發(fā)生的影響因素。目前已

3、經證實包括乳腺癌、肺癌、睪丸癌和彌漫性大B 細胞淋巴瘤等人類腫瘤中N E K 2 表達水平增高。N E K 2 在非轉化的乳腺上皮細胞中過表達會導致中心體過度復制。內源性N E K 2 表達增加導致乳腺癌細胞的中心體擴增并表達致癌的K - r a s 。從目前的研究來看，N E K 2 一在癌細胞中經常存在表達的明顯升高。雖然在腫瘤細胞中觀察到了N E K 2 的增量調節(jié)和基因不穩(wěn)定性，但是N E K 2 的上調在前列腺癌作用仍不明確。

4、在這項研究中，我們調查了人類前列腺癌組織芯片的N E K 2表達模式和抑制N E K 2 的表達對前列腺癌細胞增殖功能的改變。結果顯示N E K 2的表達與前列腺癌患者的預后密切相關?？傊?，N E K 2 過度表達可以預測前列腺癌復發(fā)。博士學位論文平均6 —8 周的裸鼠在廣州醫(yī)科大學動物實驗中心動物實驗中心飼養(yǎng)。O ．1 m l培養(yǎng)液里2 ×1 06 個細胞與等量的M a t r i g e l ( 貨號：3 5 6 2 3

5、4 ，B DB i o s c i e n c e s ) 充分混合，滅菌。轉染了N E K 2 s i R N A 的L N C a P 細胞株注射在裸鼠的左側，對照的細胞注射在裸鼠的右側。我們使用卡尺測量腫瘤，并在三個不同的時間點計算出的腫瘤的大小，然后在植入細胞4 3 天后收集腫瘤組織進行檢測。免疫組化標本在1 0 ％福爾馬林固定，隨后包埋在石蠟中。石蠟包埋的組織切成4 微米的厚度，然后脫蠟行H E 染色或免疫組織化學染色。簡要地

6、說，切片加入1 ：4 0 0N E K 2 抗體( b s 一5 7 3 2 R ，B i o s sC o L t d ．，C h i n a ) 4 ℃培養(yǎng)過夜。隨后洗滌，用過氧化物標記的多聚物及色原體基質處理以發(fā)現(xiàn)目標蛋白的染色情況，在整個免疫組化實驗中，空白對照不加一抗處理。在蘇木素復染后，兩位有經驗的病理實驗工作者各自獨立對組織的免疫染色進行評分，且這兩位工作者對患者的臨床病理報告及預后完全不知情。隨后對兩組評分數(shù)據(jù)進行比較，

7、任何有差異評分的切片都要進行重新評估，當兩位工作人員的評分一致時，癌細胞的免疫標記評估才完成。取十個典型的顯微鏡下視野并數(shù)出陽性染色細胞數(shù)，計算出陽性細胞比例。根據(jù)染色細胞的比例采取半定量的方式分成4 組：0 ( 0 ％) ，i( 1 —1 0 ％) ，2 ( 1 1 —5 0 ％) ，a n d3 ( > 5 0 ％) ．染色強度進行視覺計評分：0 ( 陰性) ，I ( 弱) ，2 ( 中度) 和3 ( 強) 。最后染色細胞比例

8、評分及染色深度評分相乘構成了最終的免疫組化評分( I R S ) 。統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)分析采用S P S S S l 3 ．O 軟件( V e r s i o n1 3 ．0 f o rW i n d o w s ，S P S SI n c ．，I L ，U S A ) 和S A S 9 ．1 軟件( S A S I n s t i t u t e ，C a r y ，N C ，U S A ) 。連續(xù)性變量資料采用義±s表示，O

9、 n e —w a yA N O V A 檢驗分析各細胞株中N E K 2 的表達情況，如有差異再用L S D等方法做兩兩比較；兩獨立樣本t 檢驗分析N E K 2m R N A 在L N C a Ps c r u m b l e 細胞和s i N E K 2 L N C a P 細胞的表達情況；T w o - w a y ．A N O V A 檢驗分析細胞增殖實驗的數(shù)據(jù)和裸鼠不同時間點皮下移植瘤的體積；P e a r s o n 卡方