蝎毒多肽提取物增強(qiáng)環(huán)磷酰胺抑制Lewis肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：肺癌已逐漸成為威脅人類健康的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率與死亡率逐年增加,己躍至癌癥死亡率的首位,其中非小細(xì)胞肺癌已占所有肺癌病例的80％以上。肺癌的治療多以手術(shù)、放療、化療等為首要的方式,但對(duì)于一些中晚期肺癌患者,往往已經(jīng)失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì),與此同時(shí),放化療既具有較嚴(yán)重的副反應(yīng),又容易出現(xiàn)放化療抗性而最終導(dǎo)致治療失敗,從而極大的限制了肺癌患者的治療,導(dǎo)致其預(yù)后非常差,致使肺癌患者五年存活率仍低于15％。環(huán)磷酰胺是一種傳統(tǒng)的抗腫瘤

2、化療藥物,其在非小細(xì)胞肺癌患者的治療中廣泛應(yīng)用,它通過(guò)干擾DNA功能,與其發(fā)生交叉聯(lián)結(jié),抑制DNA合成等機(jī)制殺滅腫瘤細(xì)胞,但是環(huán)磷酰胺是非特異性的化療藥,其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞,致使機(jī)體免疫功能下降,免疫監(jiān)視功能降低,加速腫瘤細(xì)胞逃亡、存活及增殖,最終導(dǎo)致治療失敗。中醫(yī)中藥在抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)化療療效與降低化療毒性、提高患者免疫功能、改善患者癥狀以及提高患者生存質(zhì)量等方面有其自身的優(yōu)勢(shì)。蝎毒多肽提取物便是本實(shí)驗(yàn)室從

3、東亞鉗蝎蝎毒中提取并純化的有效抗腫瘤中藥成分,其為含50～60個(gè)氨基酸的多肽混合物,它是一種耐熱、pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量為(6～7)×103,具有多種生物活性。當(dāng)前研究證實(shí),蝎毒多肽提取物在體內(nèi)外均具有顯著的抗腫瘤作用,其可改善荷瘤機(jī)體的免疫功能狀態(tài),并能與放化療聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生良好的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng),但是目前蝎毒多肽提取物的抗腫瘤細(xì)胞機(jī)制尚未完全闡明。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察蝎毒多肽提取物聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞免疫逃逸相關(guān)因子的

4、影響,探討蝎毒多肽提取物聯(lián)合環(huán)磷酰胺抗腫瘤細(xì)胞的機(jī)制。
　　 目的：觀察蝎毒多肽提取物(PESV)聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CTX)對(duì)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、PCNA的表達(dá)及對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)分化成熟的影響。進(jìn)而揭示PESV抗腫瘤作用的機(jī)制,為非小細(xì)胞肺癌患者(NSCLC)中西藥聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：1.建立Lewis肺癌小鼠皮下荷瘤模型,隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組、化療(CTX)組、PESV組和實(shí)驗(yàn)組(

5、CTX+PESV組)。記錄腫瘤生長(zhǎng)曲線,測(cè)量腫瘤體積并計(jì)算抑瘤率,觀察PESV對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。2.常規(guī)HE染色,光鏡下觀察瘤組織病理變化。3.免疫組化法檢測(cè)瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。4.逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)5.免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)瘤組織中浸潤(rùn)的DC表面共刺激分子B7-1、B7-2的表達(dá)

6、。6.免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)瘤組織中浸潤(rùn)的DC表面分子B7-1和MHC classⅡ、B7-2和MHC classⅡ的共表達(dá)
　　 結(jié)果：1.藥物干預(yù)對(duì)Lewis肺癌的影響干預(yù)21d后,與荷瘤對(duì)照組相比較,PESV組、化療組和實(shí)驗(yàn)組的小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長(zhǎng)均受到抑制,其抑制率分別為31.57％、47.32％、53.63％(P0.05)。2. PESV對(duì)小鼠Lewis肺癌瘤體中TGF-β1、VEGF、PCNA表達(dá)的影響 TGF-β

7、1、VEGF的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)顆粒主要分布于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中,PCNA棕黃色陽(yáng)性表達(dá)顆粒主要分布于細(xì)胞核內(nèi)。其中荷瘤對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率最高,表達(dá)+++以上者高達(dá)80％;CTX組和PESV組陽(yáng)性表達(dá)率次之,表達(dá)+++以上者為60％;而實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)率僅為30％。實(shí)驗(yàn)組與荷瘤對(duì)照組相比較差異非常顯著(P0.01)。3.瘤組織中DC表型B7-1、B7-2檢測(cè)熒光顯微鏡下觀察,綠色熒光信號(hào)代表陽(yáng)性表達(dá)。與荷瘤對(duì)照組相比較,PESV組中B7-1、B7

8、-2的綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度有所增強(qiáng);化療組中綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度有所下降,而實(shí)驗(yàn)組中熒光信號(hào)表達(dá)強(qiáng)度與化療組相比,強(qiáng)度和表達(dá)量均有所增加。4.瘤組織中DC表型B7-1和MHC classⅡ、B7-2和MHC classⅡ雙標(biāo)檢測(cè)明亮的綠色熒光信號(hào)代表B7-1、B7-2表型陽(yáng)性;明亮紅色熒光信號(hào)代表MHC classⅡ表型陽(yáng)性;黃色熒光信號(hào)代表B7-1和MHC classⅡ或B7-2和MHC classⅡ雙陽(yáng)性。熒光顯微鏡下觀察,各組瘤組織中均有

9、B7-1和MHC classⅡ、B7-2和MHC classⅡ的雙陽(yáng)性表達(dá)存在,與荷瘤對(duì)照組相比較,PESV組黃色熒光信號(hào)有所增加;化療組中黃色熒光信號(hào)有所下降,與化療組相比,實(shí)驗(yàn)組中黃色熒光信號(hào)的強(qiáng)度和表達(dá)量均有所增加。5. PESV對(duì)小鼠Lewis肺癌瘤組織中TGF-β1和VEGF-A mRNA表達(dá)量的影響與荷瘤對(duì)照組相比,PESV組和化療組中TGF-β1和VEGF-A的mRNA表達(dá)量均降低(P均0.05);與PESV組和化療組相比