蝎毒多肽提取物通過MICA-NKG2D途徑調(diào)控肝臟移植瘤中浸潤自然殺傷細(xì)胞活性的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　自然殺傷(Natural killer,NK)細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)重要組成部分，在肝臟、肺臟等免疫器官中含量豐富，而且與外周NK細(xì)胞相比其免疫表型、功能等表現(xiàn)出器官特異性。在正常情況下，NK細(xì)胞表面的活化性受體與靶細(xì)胞表面的配體直接結(jié)合并通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)活化靶細(xì)胞凋亡程序，從而發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用。MICA/NKG2D是NK細(xì)胞活化的主要信號通路，在NK細(xì)胞活化及誘導(dǎo)殺傷靶細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。然而在腫瘤發(fā)

2、生過程中，腫瘤細(xì)胞仍能夠通過多種途徑逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞抗原異常表達(dá)、腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子及其他免疫細(xì)胞相互作用等因素所引起的NK細(xì)胞活性降低對于誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的發(fā)生起了重要作用。因此，提高NK細(xì)胞活性，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷識別及清除作用被視為抵抗腫瘤免疫逃逸，抑制腫瘤增殖的重要渠道。
　　我們在前期研究發(fā)現(xiàn)：蝎毒多肽提取物（polypeptide extract from scorpion venom，

3、PESV）對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并通過抑制腫瘤微血管生成、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞抗原提呈，參與對腫瘤細(xì)胞的清除，但 PESV對天然免疫細(xì)胞尤其是肝臟NK細(xì)胞在抗腫瘤中的調(diào)節(jié)輔助作用尚未有相關(guān)研究，能否改善NK細(xì)胞在腫瘤患者及荷瘤小鼠中的免疫抑制效應(yīng)是我們關(guān)注研究的重點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，觀察PESV對于肝癌的相關(guān)抑制作用以及腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞的活化的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討PESV調(diào)節(jié)機(jī)體天然免疫、抗腫瘤活性提供新策略。
　

4、　方法:
　　1.PESV對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和正常人外周淋巴細(xì)胞PBLs活性的影響：采用MTT法檢測不同濃度PESV對細(xì)胞活性的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測PESV對HepG2細(xì)胞周期的影響。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測各藥物干預(yù)組對HepG2細(xì)胞表面mMICA表達(dá)比例。
　　3.LDH細(xì)胞毒性檢測法檢測NK細(xì)胞對PESV干預(yù)組HepG2細(xì)胞的殺傷作用：無菌分離正常人外周血 NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以不同藥物處理組 HepG

5、2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按不同效靶比共同培養(yǎng)4h，采用LDH細(xì)胞毒性檢測NK細(xì)胞殺傷功能。
　　4.采用直接注射法構(gòu)建 H22肝癌原位移植瘤小鼠模型，術(shù)后隨機(jī)分為荷瘤對照組（Control），PESV低劑量組（PESV-L，10mg/ml）和PESV高劑量組(PESV-H,40mg/ml)，另選取正常非手術(shù)小鼠為正常對照組(Normal)，分別給予PESV和生理鹽水連續(xù)灌胃14天后處死小鼠取肝腫瘤組織測量腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

6、另取同樣建模處理小鼠給予14天用藥干預(yù)后停藥并觀察其荷瘤生存期。
　　5.采用HE染色觀察肝臟腫瘤組織病理變化。
　　6.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肝臟、脾臟中CD3-NK1.1+細(xì)胞及其表面NKG2D的表達(dá)。
　　7.采用免疫組織化學(xué)法檢測肝臟腫瘤組織中NK1.1+細(xì)胞的浸潤。
　　8.實(shí)時(shí)定量PCR法檢測肝臟腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA表達(dá)。結(jié)果:
　　1.PESV抑制HepG2細(xì)胞活性
　　

7、MTT結(jié)果顯示：PESV能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞的活性，抑制作用呈劑量依賴性，而對PBLs細(xì)胞活性沒有明顯影響；細(xì)胞周期結(jié)果顯示PESV能顯著提高G1期HepG2細(xì)胞所占比例，使細(xì)胞增殖停滯在G1期（P<0.05）。
　　2.PESV顯著提高HepG2細(xì)胞表面mMICA的表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示不同劑量PESV作用細(xì)胞24h后HepG2細(xì)胞表面mMICA的表達(dá)顯著提高（P<0.05），與不同效靶

8、比的 NK細(xì)胞共培養(yǎng)后 NK細(xì)胞的殺傷活性顯著提高（P<0.05）。采用抗MICA抗體封閉后，NK細(xì)胞殺傷活性顯著降低，PESV未見顯著增強(qiáng)作用。
　　3.PESV抑制H22原位移植瘤小鼠腫瘤生長，延長荷瘤生存期
　　PESV大、小劑量組肝臟移植瘤的生長均受到抑制，腫瘤體積和瘤質(zhì)量均低于荷瘤對照組（P<0.05），腫瘤抑制率分別為30.77％和15.38%。生存期觀察顯示PESV大劑量組能顯著延長荷瘤小鼠生存時(shí)間，生命延長率

9、為34.06%（P<0.05）；組織病理學(xué)結(jié)果顯示荷瘤對照組肝臟腫瘤細(xì)胞排列緊密，異型性顯著，呈浸潤性生長，PESV大、小劑量組出現(xiàn)明顯壞死區(qū)，細(xì)胞異型性減輕。
　　4.PESV提高荷瘤小鼠肝臟及脾臟NK細(xì)胞浸潤，促進(jìn)其表面活化性受體NKG2D的表達(dá)
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，荷瘤對照組小鼠肝臟及脾臟NK細(xì)胞所占總淋巴細(xì)胞的頻數(shù)顯著降低，NKG2D表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），提示NK細(xì)胞出現(xiàn)免疫抑制；而PE

10、SV大劑量組小鼠肝臟NK細(xì)胞占肝臟總淋巴細(xì)胞的比例顯著高于荷瘤對照組（P<0.05），同時(shí)脾臟 NK細(xì)胞比例也顯著提高（P<0.05），NK細(xì)胞表面的活化性受體NKG2D表達(dá)在PESV組均顯著增高（P<0.05），有利于NK細(xì)胞殺傷活性的提高。免疫組化染色結(jié)果顯示，給予 PESV處理后 NK細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤程度顯著增加（P<0.05），且主要分布在癌旁組織中，腫瘤壞死區(qū)域也可見少量分布。
　　5.PESV提高NK細(xì)胞毒性顆粒的

11、表達(dá)
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，PESV大劑量組腫瘤組織中穿孔素和顆粒酶B的mRNA表達(dá)量分別是荷瘤對照組的3.62倍和5.82倍（P<0.05），表明PESV能顯著提高腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.PESV調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖;
　　2.PESV通過提高腫瘤細(xì)胞表面MICA的表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞對其殺傷活性;
　　3.PESV抑制小鼠肝臟原位移植瘤的生長，