C5aR穩(wěn)定表達株的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)自然界中最大的蛋白質(zhì)家族成員之一，存在于從低等動物酵母至人類器官，據(jù)統(tǒng)計大約1％的人類基因組編碼GPCRs而30％的藥物是以GPCRs為靶點設(shè)計的。GPCR由一條400-600個氨基酸組成的多肽鏈構(gòu)成，這條多肽鏈有7個分肽段穿越細胞膜形成7個跨膜區(qū)(transmembrane domain，TMD)。補體裂解片段C5a受體(The complement C5

2、anaphylatoxin receptor，C5aR；CD88)GPCR家族成員之一，是7次跨膜a螺旋受體，其N端在細胞外側(cè)，含有N-糖基化位點； C端在細胞內(nèi)，其上有磷酸化位點。中段七個分肽段穿越細胞膜形成7個跨膜區(qū)，它們藉6個細胞外與細胞內(nèi)由親水性氨基酸構(gòu)成的突環(huán)連接起來。細胞外3個分別稱為e1、e2及e3；細胞內(nèi)3個分別稱為i1、i2及i3。e1和e2之間由兩個保守的Cys形成一個二硫鍵。不同GPCR的TMD為分子的保守區(qū)，具

3、有極大的相似性，而兩端區(qū)域及突環(huán)的氨基酸則變異程度較大。 C5aR主要表達于中性粒細胞，嗜堿性粒細胞及單核細胞上。野生型的C5aR的表達細胞分離困難，對C5aR的功能及信號事件的研究較難進行。體外建立一個有生物學(xué)活性，穩(wěn)定表達C5aR的細胞株對我們進一步研究C5aR的生物學(xué)功能有很大的意義。 目的： 構(gòu)建重組人C5aR的真核表達載體并將其轉(zhuǎn)染入含有Ga16基因的Molt-4細胞中，獲得一株穩(wěn)定表達C5aR的細胞株

4、。為以后繼續(xù)探討C5aR的生物學(xué)功能以及C5aR單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。 方法： 通過RT-PCR從人中性粒細胞中釣取C5aR全長基因，重組到pGEM-T Easxvector中進行基因克隆，經(jīng)核酸序列測定正確后，將其克隆入真核表達載體pcDNA4.0中，轉(zhuǎn)染至Molt-4細胞系并對其進行穩(wěn)定篩選。通過Zeocin加壓及亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達C5aR的細胞株。Westen blot檢測了人標準C5a對Molt-4/C5

5、aR細胞的激活作用，細胞內(nèi)鈣離子流動檢測了Molt-4/C5aR細胞經(jīng)C5a刺激后第二信使鈣離子的調(diào)動情況，小鼠肺灌洗實驗檢測Molt-4/C5aR細胞的趨化情況。 結(jié)果： 構(gòu)建了真核表達載體pcDNA4.0/C5aR的構(gòu)建并將其轉(zhuǎn)染至Molt-4細胞。利用流式細胞術(shù)對C5aR的表達進行了檢測，正常人新鮮血液中中性粒細胞上的C5aR表達率為98.25％，而此穩(wěn)定株C5aR的表達率為97.35％，幾乎等同與正常人新鮮血

6、液中中性粒細胞上C5aR的表達量。PCR技術(shù)及Westen blot鑒定了轉(zhuǎn)染后的細胞株中仍有Ga16的存在。Westen blot顯示了人標準C5a對Molt-4/C5aR細胞的激活作用，引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化。細胞內(nèi)鈣離子流動結(jié)果顯示了Molt-4/C5aR細胞經(jīng)C5a刺激后第二信使鈣離子的調(diào)動，小鼠肺灌洗實驗說明Molt-4/C5aR細胞對C5a很好的趨化情況。 結(jié)論： 構(gòu)建了重組形式的C5aR真核

7、表達載體pcDNA4.0/C5aR,并成功轉(zhuǎn)染至Molt-4細胞中。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)MOLT-4/C5aR細胞株中Ga16沒有丟失并能夠正常表達Ga16蛋白，可以進行細胞的信號及功能研究。Westenblot試驗結(jié)果顯示MOLT-4/C5aR細胞株經(jīng)C5a刺激后能夠引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化，這更有利于我們對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行更進一步的研究并探索新的未知因子。C5a刺激MOLT-4/C5aR細胞株后可以引起鈣離子的顯著變