紫草素對尋常型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-r、IL-4的影響.pdf

1、前言：
　　 銀屑病是一種常見的易于復(fù)發(fā)的慢性炎癥性疾病,其組織病理改變的三大特點(diǎn)為角質(zhì)細(xì)胞過度增生、炎癥細(xì)胞浸潤、新生血管生成。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病存在Th1細(xì)胞分化偏態(tài)性,表現(xiàn)為銀屑病患者外周血T細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞因子IFN-γ的明顯增高以及銀屑病患者皮損T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ mRNA的過度表達(dá),且IFN-γ的含量與PASI呈明顯正相關(guān),表明以IFN-γ為代表的Th1細(xì)胞因子在銀屑病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。銀屑病患者Th1細(xì)胞可

2、分泌一系列細(xì)胞因子,如IFN-γ,YNF-β,IL-2等。有研究表明銀屑病外周血Th1/Th2細(xì)胞因子(IFN-r/IL-2)表達(dá)中,IFN-r表達(dá)顯著上調(diào),而IL-4降低。
　　 紫草為紫草科紫草屬的植物,有效成分:含乙酰紫草素(acetylshikonin)、β-羥基異戊酰紫草素(β-hydro-xyisovalerylshikonin)、紫草素(shikonin)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(β,β'-dimethylac

3、rylshikonin)等。紫草的主要藥理作用有抑菌抗病毒作用、抗腫瘤作用、抗炎癥及調(diào)節(jié)免疫的作用、避孕、降血糖作用,對凝血及消化道平滑肌、循環(huán)系統(tǒng)皆有影響。其水提物、醇提物、醚提物都有此作用。紫草在皮膚科應(yīng)用較廣,作為治療銀屑病、病毒性皮膚病等的藥物。有關(guān)紫草的研究主要是臨床療效的評價(jià),對于其對銀屑病治療的機(jī)制研究很少。本實(shí)驗(yàn)擬通過對銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn),檢測兩種主要的Th1/Th2型細(xì)胞因子(IFN-r、IL-4)的

4、水平變化從而驗(yàn)證銀屑病的Th1/Th2反應(yīng)模式,以及中藥紫草素對銀屑病外周血PBMCs分泌Th1/Th2細(xì)胞因子的影響,為紫草治療銀屑病提供一定的理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 一、研究對象和主要試劑
　　 (一)研究對象
　　 1、銀屑病患者來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科,經(jīng)臨床確診為尋常型銀屑病,共34名,男24名,女10名,年齡19-74歲(平均39±14歲),見附表1。病例要求①近一個(gè)月

5、未接受任何系統(tǒng)治療,如皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑等。②無腫瘤及其它自身免疫性疾病。③近兩周無感染史。④疾病處于進(jìn)展期。
　　 2、正常人來自自愿獻(xiàn)血者20名,男10名,女10名,年齡25-45歲(平均31±7歲),無銀屑病及其它自身免疫性疾病史,見附表2。
　　 (二)主要試劑
　　 葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)購自上海華精生物科技公司、RPMI1640培養(yǎng)液和Hank's緩沖液購自沈陽博爾美公司

6、、紫草素購自日本和光(Wako)生物試劑公司)、PHA購自Sigma公司、人IFN-r及IL-4ELISA試劑盒購自武漢博士德公司。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)ELISA法檢測血清IL4、IFN-r的含量
　　 空腹采取20名銀屑病患者及20名正常人外周血5ml,離心分離血清,ELISA法檢測IL-4、IFN-r的含量。
　　 (二)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)
　　 空腹采取14名銀

7、屑病患者及10名正常人外周血5ml,肝素抗凝,用Ficoll密度梯度法分離外周血單一核細(xì)胞(PBMC),以RPMI1640培養(yǎng)基配成1*106細(xì)胞/ml。
　　 (三)PBMCs的培養(yǎng)
　　 將PBMCs加入96孔培養(yǎng)板中,每個(gè)培養(yǎng)條件設(shè)二個(gè)復(fù)孔。放入37℃,5％CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)72后收集上清液。正常人PBMCs分為兩組:空白組(PBMCs+RPMI1640培養(yǎng)液)和PHA組(PBMCs+12.5ug/mlPHA+RP

8、MI1640培養(yǎng)液)。將銀屑病患者PBMCs分為八組,分組為:空白組(PBMCs+RPMI1640培養(yǎng)液)、低濃度紫草素組(PBMCs+2.5ug/ml紫草素+RPMI1640培養(yǎng)液)、中濃度紫草素組(PBMCs+7ug/ml紫草素+RPMI1640培養(yǎng)液)、高濃度紫草素組(PBMCs+12.5ug/ml紫草素+RPMI1640培養(yǎng)液)、PHA組(PBMCs+12.5ug/mlPHA+RPMI1640培養(yǎng)液)、PHA+低濃度紫草素組(P

9、BMCs+12.5 ug/mlPHA+2.5ug/ml紫草素+RPMI1640培養(yǎng)液)、PHA+中濃度紫草素組(PBMCs+12.5ug/mlPHA+7ug/ml紫草素+RPMI1640培養(yǎng)液)、PHA+高濃度紫草素組(PBMCs+12.5ug/mlPHA+12.5ug/ml紫草素+RPMI1640培養(yǎng)液)。
　　 (四)ELISA法檢測各PBMCs培養(yǎng)上清液中IFN-r/IL-4含量
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 (

10、一)病例組較對照組血清中IFN-r含量明顯升高,IL-4含量下降
　　 與正常人相比,患者血清中IFN-r含量明顯升高,血清中IL-4含量下降。
　　 (二)不同培養(yǎng)條件下PBMCs培養(yǎng)上清中IFN-r的水平
　　 PHA刺激下,銀屑病患者和正常人均較無PHA刺激時(shí)PBMCs培養(yǎng)上清IFN-r明顯升高。但不論有無PHA刺激,銀屑病患者PBMCs培養(yǎng)上清IFN-r較正常人明顯升高。隨著紫草素濃度增加,銀屑病患者PB

11、MCs培養(yǎng)上清中IFN-r逐漸下降。
　　 (三)不同培養(yǎng)條件下PBMCs培養(yǎng)上清中IL-4的水平
　　 PHA刺激下,銀屑病患者和正常人均較無PHA刺激時(shí)PBMCs培養(yǎng)上清IL-4明顯升高。但不論有無PHA刺激,銀屑病患者PBMCs培養(yǎng)上清中IL-4較正常人降低。隨著紫草素濃度增加,銀屑病患者PBMCs培養(yǎng)上清中IL-4逐漸升高。
　　 結(jié)論：
　　 紫草素能抑制Th1型細(xì)胞因子IFN-r的分泌,而促進(jìn)