TNF-α對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎P-糖蛋白的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分P-糖蛋白與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多藥耐藥及TNF-α水平的相關(guān)性研究。
　　 目的：檢測(cè)正常對(duì)照組、RA初發(fā)未治組、RA治療有效組、RA難治組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp表達(dá)和功能、TNF-α mRNA，血清TNF-α水平，分析P-gp與RA多藥耐藥及TNF-α相關(guān)性，探討P-gp、TNF-α在RA多藥耐藥中的作用及其相關(guān)性。
　　 方法：入選RA初治組、治療有效組、難治組患者和正常對(duì)照組各20例為研究對(duì)象。RA初治組未

2、經(jīng)任何DMARDs及生物制劑治療。RA治療有效組和難治組以聯(lián)合甲氨蝶呤、來(lái)氟米特為基礎(chǔ)治療藥物，未經(jīng)糖皮質(zhì)激素和生物制劑治療。入組RA患者進(jìn)行疾病活動(dòng)度評(píng)分(DAS28)。采集入組患者血標(biāo)本進(jìn)行血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞的P-gp的表達(dá)，羅丹明123蓄積試驗(yàn)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞的P-gp的功能，RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA水平，ELISA檢測(cè)血清TNF-α濃度。
　　

3、結(jié)果：
　　 1.外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp的表達(dá)和功能：在正常對(duì)照組有P-gp表達(dá)，但表達(dá)量和功能低；RA初治組、RA治療有效組及RA難治組P-gp表達(dá)和功能均高于正常對(duì)照；RA難治組P-gp的表達(dá)和功能較RA初治組、RA治療有效組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；RA初治組P-gp的表達(dá)和功能高于RA治療有效組(P<0.05)。
　　 2.外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA和血清TNF-α水平：正常對(duì)照組T

4、NF-α mRNA表達(dá)水平明顯低于RA各組(P<0.01)。RA各組TNF-α mRNA表達(dá)水平兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，其中RA難治組TNF-α mRNA表達(dá)水平最高，RA治療有效組TNF-α mRNA表達(dá)水平最低。RA各組血清TNF-α含量較正常對(duì)照組高(P<0.01)，其中RA難治組明顯高于RA初治組和RA治療有效組(P<0.01)，RA初治組高于RA治療有效組(P<0.01)。
　　 3.RA各組疾病活

5、動(dòng)的比較：RA初治組DAS28評(píng)分為5.70±1.46，明顯高于RA治療有效組(3.78±0.79，P<0.01)；RA難治組DAS28評(píng)分為7.02±0.93，明顯高于其它兩組(P<0.01)。
　　 4.PBMC P-gp的表達(dá)和功能與TNF-α mRNA、血清TNF-α水平和疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析：PBMC P-gP的表達(dá)與PBMC TNF-αmRNA水平、血清TNF-α的水平均呈正相關(guān)(r=0.29，P<0.01；r=0

6、.758，P<0.01)；羅丹明蓄積細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與PBMC TNF-αmRNA、血清TNF-α的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.843，P<0.01；r=-0.863，P<0.01)。PBMC P-gp的表達(dá)與DAS28做相關(guān)性分析，顯示二者呈正相關(guān)(r=0.588，P<0.01)，羅丹明蓄積細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與DAS28做相關(guān)性分析，顯示二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.702，P<0.01)。
　　 5.PBMC P-gP的表達(dá)和功能與病程和用

7、藥時(shí)間的相關(guān)性分析：P-gp表達(dá)和功能與RA的病程和用藥時(shí)間無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RA難治組的PBMC P-gp表達(dá)和功能明顯高于與RA初治組和RA治療有效組，P-gp表達(dá)升高功能增強(qiáng)與RA的難治程度有關(guān)，P-gp參與難治性RA多藥耐藥的形成。
　　 2.RA治療有效組P-gp表達(dá)和功能較RA初治組下降，且RA各組P-gp表達(dá)和功能與疾病活動(dòng)評(píng)分DAS28呈正相關(guān)，提示P-gp可作為RA治療效果的

8、監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。
　　 3.P-gp表達(dá)和功能與RA的病程和用藥時(shí)間無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。
　　 4.P-gp表達(dá)和功能與PBMC TNF-α mRNA、血清TNF-α呈正相關(guān)，TNF-α可能參與P-gp介導(dǎo)的RRA多藥耐藥的形成。
　　 5.P-gp的表達(dá)和活性受原發(fā)耐藥、繼發(fā)耐藥、疾病活動(dòng)內(nèi)環(huán)境改變等多重因素的影響。疾病活動(dòng)內(nèi)環(huán)境改變可能在RA P-gp的表達(dá)和活性增強(qiáng)中起著重要作用。
　　 第二部分 TNF-α

9、對(duì)RA外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gp表達(dá)及活性的影響。
　　 目的：觀察TNF-α對(duì)RA外周血單個(gè)核細(xì)胞后P-gp表達(dá)及活性的影響，探討TNF-α在RA MDR形成中的作用。
　　 方法：入選RA初治組、治療有效組、難治組患者和正常對(duì)照組各20例為研究對(duì)象。采集入組患者血標(biāo)本并進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離，以終濃度0.5ng/ml的TNF-α作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)，分別在TNF-α干預(yù)前和

10、干預(yù)后2h、6h、12h、24h后，收集細(xì)胞，流式檢測(cè)PBMC P-gp的表達(dá)，羅丹明123蓄積試驗(yàn)檢測(cè)PBMC P-gp功能。
　　 結(jié)果：在TNF-α預(yù)2h后，各組P-gp的表達(dá)與干預(yù)前無(wú)明顯變化，但Rh123蓄積試驗(yàn)熒光強(qiáng)度下降，即P-gp的功能增強(qiáng)。干預(yù)12h各組的P-gp的表達(dá)和功能都能達(dá)到最大值并維持在高水平的平臺(tái)上。干預(yù)12h與干預(yù)24h P-gp的表達(dá)和功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在6h和12h的P-gp的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，

11、各組在起效時(shí)間和達(dá)峰時(shí)間上不一致。在正常對(duì)照組干預(yù)6h，P-gp的表達(dá)較干預(yù)前升高(P<0.05)，干預(yù)12h P-gp的表達(dá)達(dá)峰。在RA初治組，在干預(yù)6h，P-gp的表達(dá)較干預(yù)前升高(P<0.05)，干預(yù)12h P-gp的表達(dá)達(dá)峰。在RA治療有效組，干預(yù)12h，P-gp的表達(dá)才較干預(yù)前升高(P<0.01)并達(dá)到峰值。在RA難治組，干預(yù)6h P-gp的表達(dá)較干預(yù)前明顯升高(P<0.01)并達(dá)峰。干預(yù)12h P-gP的表達(dá)和功能達(dá)峰，比較

12、各組P-gp的表達(dá)和功能的情況，RA各組P-gp表達(dá)和功能高于正常對(duì)照組(P<0.01)；RA各組中難治組P-gP表達(dá)最高、功能最強(qiáng)，治療有效組P-gp表達(dá)最低、功能最弱。
　　 結(jié)論：
　　 1.TNF-α可增強(qiáng)RA患者的PBMC P-gp的表達(dá)和功能，介導(dǎo)RA的多藥耐藥，參與難治性類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生。
　　 2.RA各組PBMC對(duì)相同濃度的TNF-α刺激上調(diào)P-gp的速度和效率不同，難治組起效和達(dá)峰所需時(shí)間短

13、，治療有效組起效和達(dá)峰所需時(shí)間長(zhǎng)，這種差異性可能與細(xì)胞自身對(duì)TNF-α的內(nèi)在反應(yīng)性有關(guān)。
　　 3.TNF-α對(duì)各組PBMC P-gp的表達(dá)和功能的影響，在作用12h均可達(dá)到最大值，此后維持在高水平的平臺(tái)上。
　　 4.RA P-gp表達(dá)和活性增高的機(jī)制復(fù)雜，TNF-α的作用僅為影響P-gp的表達(dá)和活性增高的機(jī)制之一。
　　 第三部分 TNF-α對(duì)RA外周血單個(gè)核細(xì)胞P-gP調(diào)控機(jī)制的研究。
　　 目的：

14、研究TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的MAPKs(ERK1/2、JNK和p38)及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在TNF-α增強(qiáng)RA PBMC P-gp表達(dá)和活性中的作用，探討TNF-α對(duì)RA PBMC P-gP的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：入選RA初治組患者20例，采集入組患者血標(biāo)本并進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離。每份標(biāo)本設(shè)6組：A組、B組、C組、D組、E組和F組。A組為空白對(duì)照組。在C、D、E、F組分別加入NF-κB、JNK、ERK1/2、p38

15、的抑制劑PDTC、SP600125、U0126、SB202190進(jìn)行預(yù)處理。處理30min后，B、C、D、E、F組均加入TNF-α，調(diào)整TNF-α終濃度為0.5ng/ml，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)，12h后收集細(xì)胞，流式檢測(cè)PBMC P-gP的表達(dá)，羅丹明蓄積試驗(yàn)檢測(cè)PBMC P-gP功能。
　　 結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，TNF-α組P-gp表達(dá)升高(P<0.01)，Rh123熒光強(qiáng)度降低(P<0.01)即P-g

16、p功能增強(qiáng)。用PDTC預(yù)處理抑制NF-κB活性或P600125預(yù)處理抑制JNK活性，與未預(yù)處理的TNF-α組相比，預(yù)處理組P-gp表達(dá)降低、功能減弱。用U0126預(yù)處理抑制ERK1/2活性或SB202190預(yù)處理抑制p38活性，與未預(yù)處理的TNF-α組相比，兩組P-gp表達(dá)和功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　 結(jié)論：
　　 1.NF-κB的抑制劑PDTC和JNK抑制劑SP600125均可下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的RA PBMC P-g

17、P的表達(dá)增加和功能增強(qiáng)。NF-κB和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)TNF-α對(duì)RA PBMC P-gP的表達(dá)和功能的調(diào)控。
　　 2.ERK1/2抑制劑U0126和p38-MAPK抑制劑SB202190對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的RA PBMC P-gP的表達(dá)增加和功能增強(qiáng)無(wú)影響。ERK1/2通路和p38-MAPK信號(hào)通路不直接參與TNF-α對(duì)RA PBMC P-gp的表達(dá)和功能的調(diào)控。
　　 3.TNF-α通過(guò)NFκB和JN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路