Id-1與HBx在乙肝相關(guān)性肝癌成瘤過程中相互作用的研究.pdf

1、【背景】原發(fā)性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球發(fā)病率第五位的常見惡性腫瘤。在亞洲和大洋洲國(guó)家，特別是中國(guó)大陸，肝癌發(fā)病的主要誘因是慢性乙型肝炎病毒（hepatitisB，HBV）感染。對(duì)肝癌的早期診斷是提高肝癌患者療效和預(yù)后的關(guān)鍵。目前包括肝癌切除術(shù)和肝移植在內(nèi)的外科手術(shù)療法仍是治療早期肝癌的首選。然而，只有不到30％的患者能夠在早期被診斷出肝癌并接受合適的治療，大多數(shù)進(jìn)展期患者由于治療不及時(shí)而無法獲

2、得較理想的預(yù)后。由于我國(guó)眾多的乙肝病毒攜帶者是肝癌的危險(xiǎn)人群，更要求我們?cè)谠缙诎l(fā)現(xiàn)并預(yù)測(cè)肝癌方面進(jìn)行的研究，以期獲得更好的肝癌的腫瘤標(biāo)記物和預(yù)測(cè)因子。
　　乙肝病毒感染在肝癌的發(fā)病過程中起到了重要作用，在中國(guó)大陸，約80％以上的肝癌患者伴隨著慢性乙肝病毒的感染。即便是HBV的隱匿性感染者，甚至是乙肝表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg）在體內(nèi)已被廓清后的曾經(jīng)感染者，其肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍高于普通人群。

3、乙肝病毒可以整合入宿主基因組，并直接或間接的促進(jìn)肝癌的發(fā)生。在這個(gè)過程中，乙肝病毒X蛋白（hepatitisBvirusXprotein，HBxprotein）起到了重要的促進(jìn)作用。HBx是由HBV-DNA中最短的開放讀取框所編碼的。它增強(qiáng)了HBV的轉(zhuǎn)錄，并激活了癌基因、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等不同細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄過程。HBx和其它多種因子如p53、DDB1、Caspase3和蛋白酶體亞單位等相互作用，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在肝癌患者血清和肝癌組織中

4、均可檢測(cè)到高水平HBxAg和抗-HBx的表達(dá)。
　　Id蛋白即分化抑制蛋白或DNA結(jié)合抑制蛋白（InhibitorofDifferentiationand/orDNA-bindingProtein）。由于Id蛋白缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它與其它堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（bHLH）結(jié)合后可形成沒有DNA結(jié)合能力的異二聚體，起到了負(fù)性調(diào)節(jié)作用。作為Id蛋白家族的一員，Id-1在細(xì)胞分化過程中起到了重要的作用，它在包括肝癌在內(nèi)的多種人類

5、腫瘤中高表達(dá)。不受控制的Id-1蛋白表達(dá)將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化抑制、并刺激腫瘤血管生成及誘發(fā)基因組失穩(wěn)。Id-1表達(dá)水平往往和腫瘤的高侵襲性、去分化程度和較差的臨床預(yù)后相關(guān)。高表達(dá)的Id-1可以介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖，并且可成為預(yù)測(cè)慢性肝炎肝硬化患者肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。Id-1可能在肝癌形成過程中的發(fā)揮重要作用，而它與HBV之間的關(guān)系值得進(jìn)一步深入研究。
　　【目的】（1）檢測(cè)Id-1和HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)情況。（

6、2）分析乙肝相關(guān)性肝癌患者臨床病理學(xué)特征與Id-1及HBx蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。（3）檢測(cè)Id-1和HBx在肝癌細(xì)胞中的共定位情況。（4）檢測(cè)HBx對(duì)肝癌細(xì)胞系中Id-1表達(dá)水平的影響。（5）構(gòu)建人Id-1干擾慢病毒載體。（6）人Id-1干擾慢病毒載體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的感染驗(yàn)證。
　　【方法】（1）對(duì)獲得的96例乙肝相關(guān)性肝癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，并對(duì)Id-1和HBx蛋白的染色結(jié)果進(jìn)行分級(jí)。（2）借助SPSS軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析I

7、d-1和HBx的蛋白表達(dá)水平與肝癌臨床病理學(xué)特征間的相關(guān)性以及Id-1的表達(dá)強(qiáng)度和乙肝相關(guān)性肝癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。（3）用激光共聚焦免疫熒光染色法研究Id-1和HBx在肝癌細(xì)胞中的共定位情況。（4）Realtime-PCR和WesternBlot分別檢測(cè)Id-1mRNA和蛋白在肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721、FHCC98和肝細(xì)胞系HL7702中的表達(dá)情況。（5）Realtime-PCR和WesternBl

8、ot檢測(cè)Id-1蛋白在轉(zhuǎn)染入HBx的肝癌HepG2-X和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HepG2-PC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。（6）采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Id-1啟動(dòng)子序列在HepG2-X和HepG2-PC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。（7）篩選獲得效率最高的Id-1RNA干擾序列并構(gòu)建人Id-1干擾慢病毒載體。（8）驗(yàn)證人Id-1干擾慢病毒載體對(duì)HepG2細(xì)胞中Id-1的沉默效果。
　　【結(jié)果】（1）免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在96例乙肝相關(guān)性肝癌標(biāo)本中，Id-1高

9、表達(dá)率為64.6％，HBx的高表達(dá)率為74.0％。且Id-1的表達(dá)強(qiáng)度與HBx的表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)。（2）Id-1高表達(dá)水平與患者的血清高HBsAg水平、較差的腫瘤分化程度、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ChildB/C級(jí)之間關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Id-1高表達(dá)組的無瘤生存率和總生存率均較Id-1低表達(dá)組更差。（3）成對(duì)免疫組化染色和激光共聚焦免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Id-1和HBx在肝癌細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象，二者主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。（4）經(jīng)Real

10、time-PCR和WesternBlot發(fā)現(xiàn)Id-1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)強(qiáng)度在肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721和FHCC98中均顯著高于肝細(xì)胞系HL7702。（5）在肝癌HepG2-X中，Id-1的mRNA和蛋白表達(dá)強(qiáng)度均高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HepG2-PC細(xì)胞。（6）報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HepG2-X細(xì)胞中被激活的Id-1啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度高于HepG2-PC細(xì)胞。（7）成功篩選并構(gòu)建了人Id-1干擾慢病毒載

11、體Id1-RNAi-LV，經(jīng)鑒定病毒滴度為2.0×10E9TU/mL；在HepG2細(xì)胞中，該載體對(duì)HepG2細(xì)胞中Id-1的mRNA和蛋白的表達(dá)均有明顯抑制效果，抑制效率為61.2％。
　　【結(jié)論】（1）乙肝相關(guān)性肝癌標(biāo)本中，Id-1和HBx均有表達(dá)，并且二者存在共定位現(xiàn)象。（2）Id-1蛋白的表達(dá)水平與乙肝相關(guān)性肝癌患者血清HBsAg水平、腫瘤分化程度、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Child分級(jí)等腫瘤惡性表型相關(guān)；Id-1高表達(dá)組患

12、者有較差的預(yù)后。（3）Id-1在多種肝癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，且其表達(dá)強(qiáng)度高于正常肝細(xì)胞系。（4）被轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中HBx，可提高Id-1啟動(dòng)子活性并使Id-1在mRNA及蛋白水平表達(dá)升高。（5）成功構(gòu)建了Id-1干擾慢病毒載體Id1-RNAi-LV，并對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞系中的Id-1基因有mRNA和蛋白水平的沉默效果。（6）綜上Id-1可以作為乙肝相關(guān)性肝癌患者一個(gè)有用的預(yù)后指標(biāo)。乙肝相關(guān)性肝癌標(biāo)本中高表達(dá)的Id-1至少部分的受H