腫瘤細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)錄載體的研究.pdf

1、基因治療的一個(gè)主要問題是對(duì)治療基因表達(dá)的空間和時(shí)間的控制。一些腫瘤治療方案中，轉(zhuǎn)移基因在腫瘤外組織和細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致正常組織的破壞和難以預(yù)料的毒性。因此，如果能以精確地調(diào)控或特異性地靶向表達(dá)的方式控制治療基因的表達(dá)，則可極大地提高基因治療的安全性和有效性。人端粒酶活性與腫瘤細(xì)胞之間有良好的相關(guān)性，85％以上的惡性腫瘤端粒酶活性被重新激活，而絕大多數(shù)成年體細(xì)胞的端粒酶活性為陰性。實(shí)驗(yàn)證明，端粒酶催化亞基(humantelomerasere

2、versetranscriptase，hTERT)的激活表達(dá)是端粒酶活性重新激活的限速步驟。根據(jù)hTERT在腫瘤細(xì)胞中的重新激活而在正常體細(xì)胞中沉默的特點(diǎn)，提示可應(yīng)用催化亞基的調(diào)控表達(dá)序列，構(gòu)建腫瘤細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)錄載體，為腫瘤的生物治療提供一種新的特異性表達(dá)系統(tǒng)。本研究應(yīng)用hTERT的啟動(dòng)子序列構(gòu)建腫瘤細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。以端粒酶催化亞基起始轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游-1到-2069段的啟動(dòng)子序列分別構(gòu)建調(diào)控報(bào)道基因EGFP、P53和TK的逆轉(zhuǎn)錄

3、病毒載體pRH2kbEGFP、pRH2kbP53、pRH2kbTK。以脂質(zhì)體為介導(dǎo)分別將這些載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染端粒酶活性陽性的腫瘤細(xì)胞株，如Hela、HepG2、T24、B16、HT29、A594、ECV304、CCC等，端粒酶活性陽性的永生細(xì)胞株，如293細(xì)胞，及端粒酶活性陰性的正常體細(xì)胞株，如WI38細(xì)胞、2BS細(xì)胞等。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，熒光顯微鏡鏡檢，在端粒酶活性為陽性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞，永生化細(xì)胞)中，檢測(cè)到發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，而在

4、端粒酶活性為陰性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中沒有檢測(cè)到發(fā)綠色熒光的細(xì)胞。說明人端粒酶催化亞基啟動(dòng)子可在腫瘤細(xì)胞中靶向性轉(zhuǎn)錄報(bào)道基因。而用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染了pRH2kbP53的細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡率為19％±2％，轉(zhuǎn)染的ECV304細(xì)胞為19％±2％，轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞為14％±3％，轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞為17％±3％，轉(zhuǎn)染的2BS細(xì)胞的凋亡率僅為0.40％±1％；而以pCMV啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的p53基因，轉(zhuǎn)染HepG2后的凋亡率達(dá)2

5、8％±3％。說明人端粒酶催化亞基啟動(dòng)子的強(qiáng)度比pCMV啟動(dòng)子弱，但調(diào)控表達(dá)治療基因的量足以引起轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。將pRH2kbTK載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HrpG2，在潮霉素B(400μg/ml)的壓力下選擇10天，得穩(wěn)定克隆，在30μM的GCV存在下，7天的時(shí)間，穩(wěn)定克隆全部死亡。取20％穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2克隆細(xì)胞，80％的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，混合培養(yǎng)，而在30μM的GCV存在下5天，60％的細(xì)胞死亡，而未加轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則正常生長(zhǎng)，從而顯示出旁觀者效