血小板靶向載體系統(tǒng)的制備及其抗血液腫瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、第一部分功能化血小板載體裝載顯像劑靶向成像體內(nèi)異種種植瘤
　　目的:眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血小板能夠進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中與腫瘤細(xì)胞相互作用，并且在腫瘤微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。因此，本文嘗試在血小板內(nèi)部裝載顯像劑、在血小板表面聯(lián)接外源性的能夠靶向識(shí)別特定腫瘤細(xì)胞的蛋白或抗體分子，來(lái)制備功能化血小板靶向載體。功能化血小板靶向載體能夠靶向識(shí)別體內(nèi)的特定腫瘤細(xì)胞并更多地聚集于腫瘤微環(huán)境中，從而達(dá)到對(duì)體內(nèi)腫瘤部位靶向成像的目的。
　　方法:

2、制備功能化血小板靶向載體的步驟如下:1）血小板首先攝入kabiramide C(KabC)形成KabC-血小板，利用流式細(xì)胞儀定量?jī)?yōu)化KabC的最佳反應(yīng)濃度，并用激光共聚焦顯微鏡和掃描及透射電子顯微鏡定性觀察KabC-血小板的形態(tài)。2）穩(wěn)定的KabC-血小板進(jìn)一步攝取能夠通過(guò)細(xì)胞膜的化合物形成載藥KabC-血小板。本文中采用的化合物包括表阿霉素(Epidoxorubicin，EPI)、5(6)-羧基熒光素二乙酸酯(Carboxyfluo

3、rescein Di-ester，CFDA)、二氫卟吩E6(Chlorin E6，CE6)，利用流式細(xì)胞儀定量?jī)?yōu)化各化合物的最佳反應(yīng)濃度，并用激光共聚焦顯微鏡定性觀察載藥KabC-血小板的形態(tài)。3）在載藥KabC-血小板的表面利用化學(xué)鍵聯(lián)接上外源性的能靶向識(shí)別特定腫瘤細(xì)胞（人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562）的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子(Transferrin，Tf)，并聯(lián)接上熒光分子以獲得功能化血小板靶向載體。利用流式

4、細(xì)胞儀定量?jī)?yōu)化制備功能化血小板靶向載體的最佳反應(yīng)條件，并用激光共聚焦顯微鏡定性觀察功能化血小板靶向載體的形態(tài)及其在體外與RPMI8226和K562細(xì)胞之間的相互作用。4）利用動(dòng)物活體成像儀觀察功能化血小板靶向載體在荷皮下和顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞種植瘤的小鼠體內(nèi)的分布規(guī)律，并用激光共聚焦顯微鏡觀察功能化血小板靶向載體在顱內(nèi)RPMI8226細(xì)胞種植瘤的組織切片內(nèi)的分布。
　　結(jié)果:KabC能夠有效地抑制血小板胞漿內(nèi)肌動(dòng)蛋白的聚合反應(yīng)，使得血小板

5、在制備過(guò)程中不發(fā)生特異性或非特異性的變形或聚集形成血栓。穩(wěn)定的KabC-血小板能夠在胞漿內(nèi)裝載多種化合物，并且其表面能夠被聯(lián)接上外源性的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子和熒光分子。激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果表明，表面標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白分子和熒光分子的血小板靶向載體KabC-血小板-Cy5 Tf能夠特異性粘附在表面高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤細(xì)胞RPMI8226和K562細(xì)胞表面?；铙w成像觀察結(jié)果表明，KabC-血小板-Cy7 Tf在荷異種種植瘤的小鼠體內(nèi)的半衰期可

6、達(dá)144 h，顯著增加了識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞的幾率，能夠特異性聚集在體內(nèi)種植瘤部位，并且能夠顯像早期體積較小的顱內(nèi)RPMI8226細(xì)胞種植瘤。
　　結(jié)論:KabC-血小板不易發(fā)生變形或聚集，是一種新型、穩(wěn)定的天然藥物載體，在其內(nèi)部裝載其他藥物或顯像劑，同時(shí)在其表面聯(lián)接靶向蛋白分子或熒光分子后可以靶向成像體內(nèi)特定腫瘤。
　　第二部分功能化納米血小板載體裝載顯像劑和藥物靶向成像及治療體內(nèi)異種種植瘤
　　目的:第一部分論文中的功能化

7、血小板靶向載體雖然能夠高效地靶向特定腫瘤組織，卻不易釋放出其內(nèi)容物，并且因體積較大而不能被靶細(xì)胞內(nèi)吞。因此，需要采取額外的措施促使其在腫瘤微環(huán)境中釋放出藥物達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，比如通過(guò)裝載光動(dòng)力學(xué)化合物CE6在血小板內(nèi)產(chǎn)生氧自由基從而破壞血小板膜釋放出藥物。在本部分論文中，從縮小血小板體積使其能夠被靶細(xì)胞內(nèi)吞的角度出發(fā)，通過(guò)超聲粉碎的方式將完整血小板制成一種新型的生物納米載體一納米血小板靶向載體。功能化納米血小板靶向載體能夠靶向識(shí)別

8、特定腫瘤細(xì)胞并被其內(nèi)吞，從而將顯像劑或細(xì)胞毒性藥物遞送進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到對(duì)腫瘤組織進(jìn)行靶向成像及治療的目的。
　　方法:按第一部分論文中的方法制備獲得KabC-血小板后，再通過(guò)溫和的超聲處理使其被粉碎成KabC-納米血小板，利用流式細(xì)胞儀、動(dòng)態(tài)光散射儀和掃描及透射電子顯微鏡表征KabC-納米血小板的大小和結(jié)構(gòu)。用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀優(yōu)化功能化納米血小板靶向載體(載藥KabC-納米血小板-Tf)的制備條件。用激光共聚焦顯微鏡

9、觀察人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226與KabC-納米血小板-Cy5 Tf之間的相互作用。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)載表阿霉素(Epidoxorubicin，EPI)的KabC-納米血小板-Tf能否被腫瘤細(xì)胞所內(nèi)吞及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡;用活體成像儀檢測(cè)KabC-納米血小板-Cy7 Tf在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布規(guī)律;最后觀察載EPI的KabC-納米血小板-Tf對(duì)小鼠皮下RPMI8226細(xì)胞種植瘤的生長(zhǎng)抑制作用，通過(guò)對(duì)瘤組織進(jìn)行病理切片分析驗(yàn)證載EPI的K

10、abC-納米血小板-Tf能否在體內(nèi)靶向識(shí)別特定的腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　結(jié)果:KabC-納米血小板的平均直徑約70～250 nm，膜結(jié)構(gòu)完整，含有與其母細(xì)胞KabC-血小板相似的內(nèi)容物，也能夠在胞漿內(nèi)裝載具有膜通透性的藥物(KabC、EPI)，并在表面聯(lián)接上外源性蛋白分子(轉(zhuǎn)鐵蛋白，Tf)和熒光分子（Cy5-NHS、Cy7-NHS）。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，KabC-納米血小板-Cy5 Tf能夠特異性地靶向表面高表

11、達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子的RPMI8226細(xì)胞，并且被RPMI8226細(xì)胞所內(nèi)吞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，RPMI8226細(xì)胞內(nèi)吞靶向載體EPI-KabC-納米血小板-Tf的量約是內(nèi)吞非靶向載體EPI-KabC-納米血小板量的2.5倍，EPI-KabC-納米血小板-Tf對(duì)RPMI8226細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于EPI-KabC-納米血小板，從而證明內(nèi)吞作用是通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體之間的特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。動(dòng)物活體成像結(jié)果表明KabC-納米血