清醒狀態(tài)下小鼠背根神經(jīng)節(jié)活體成像觀測模型的建立及其在疼痛研究中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的:建立清醒狀態(tài)下小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG，dorsal root ganglion)觀測模型，并初步應(yīng)用于疼痛研究中，觀察疼痛模型中背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元的放電變化，為清醒狀態(tài)下疼痛模型小鼠背根神經(jīng)節(jié)觀測提供可行方法。
　　方法:本研究分為三部分:
　　1.建立清醒狀態(tài)下小鼠背根神經(jīng)節(jié)雙光子熒光顯微鏡成像觀察模型:研究對象為體重20-25g成年YFP（Yellow Fluorescent Protein，黃色熒光蛋白）轉(zhuǎn)基因熒

2、光小鼠和GFP（Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白）轉(zhuǎn)基因熒光小鼠。通過自制的一套小鼠脊椎固定裝置，建立背根神經(jīng)節(jié)雙光子熒光顯微鏡觀察窗，并對清醒狀態(tài)下背根神經(jīng)節(jié)觀察模型進行成像時長、炎癥反應(yīng)、運動學(xué)和行為學(xué)驗證。該模型驗證指標(biāo)包括:成像時長;第1天和第7天兩時間段，背根神經(jīng)節(jié)固有炎癥相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞的密度變化;1-3天，4-6天，8-10天，14-15天四個不同階段的平均運動速度、后足距、步幅、靜止時間、

3、整飾時間、進食時間;術(shù)后即時，1-3天，4-6天，8-10天，14-15天五個不同階段的最大運動速度。另外，通過雙光子熒光顯微鏡成像效果和脊髓灰質(zhì)區(qū)電勢差記錄效果，初步檢測該裝置在清醒狀態(tài)下脊髓側(cè)面及脊髓背側(cè)觀察模型和脊髓灰質(zhì)電勢差記錄模型中的制動效果。
　　2.小鼠背根神經(jīng)節(jié)AAV-CAG-GcaMP6(Adeno-associated virus-CAG-GFPbased-Calcium CaM probe，腺相關(guān)病毒-cag

4、啟動子-綠色熒光蛋白結(jié)合鈣調(diào)蛋白和M13肽段探針）病毒注射及清醒狀態(tài)下雙光子熒光顯微鏡成像觀察:研究對象為體重20-25g成年C57BL/6j(C57)小鼠。通過自制的一套小鼠脊椎固定裝置對脊椎進行固定，暴露背根神經(jīng)節(jié)，并進行背根神經(jīng)節(jié)AAV-CAG-GcaMP6病毒注射。病毒注射14-18天后，通過雙光子熒光顯微鏡成像進行制動效果驗證和AAV-CAG-GcaMP6病毒注射后GcaMP6轉(zhuǎn)染效果檢測。
　　3.小鼠疼痛模型的建立及

5、活體清醒狀態(tài)下小鼠背根神經(jīng)節(jié)雙光子熒光顯微鏡成像觀察:研究對象為體重20-25g成年C57BL/6j(C57)小鼠。通過自制的一套小鼠脊椎固定裝置對脊椎進行固定，暴露背根神經(jīng)節(jié)，并進行背根神經(jīng)節(jié)AAV-CAG-GcaMP6病毒注射。應(yīng)用小鼠足底注射福爾馬林建立疼痛模型。通過雙光子熒光顯微鏡成像檢測制動效果和GcaMP6轉(zhuǎn)染效果，并初步觀察疼痛模型中背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元的放電變化。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立了清醒狀態(tài)下小鼠背

6、根神經(jīng)節(jié)雙光子熒光顯微鏡成像觀察模型:小鼠制動效果良好，且能實現(xiàn)YFP轉(zhuǎn)基因小鼠背根神經(jīng)節(jié)長期活體觀察。裝置植入后運動功能得以保留。手術(shù)后連續(xù)15天連續(xù)成像，能持續(xù)穩(wěn)定顯示背根神經(jīng)節(jié)中假單級神經(jīng)元，神經(jīng)元胞核，軸突和樹突形態(tài)和數(shù)量。術(shù)后第7天，背根神經(jīng)節(jié)中小膠質(zhì)細(xì)明顯增多。小鼠內(nèi)置裝置后連續(xù)1-3天，4-6天，8-10天，14-15天，足間距（后肢的橫向距離），步幅長度，以及奔跑速度，在任意時間點，我們都沒有發(fā)現(xiàn)其步態(tài)有差異;術(shù)后1-3

7、天，4-6天時，小鼠整飾時間會明顯增加，但是，隨著時間延長，這種差異會逐漸消失。不同時間段小鼠進食時間并未發(fā)現(xiàn)差異。另外，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)置裝置的小鼠的最快速度會有些輕微的變化，但是并沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，應(yīng)用該裝置能夠滿足清醒狀態(tài)下脊髓側(cè)/背面成像及脊髓灰質(zhì)區(qū)電勢差隨運動變化信號錄入時的制動要求。
　　2.實現(xiàn)了AAV-CAG-GcaMP6病毒注射，并且GcaMP6病毒轉(zhuǎn)染效果良好。病毒注射14-18天后，我們能夠清晰觀察到整個背根神

8、經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元，并發(fā)現(xiàn)背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元能夠隨著電刺激發(fā)生相應(yīng)的放電活動。
　　3.該清醒狀態(tài)下小鼠背根神經(jīng)節(jié)觀察模型能夠很好的與疼痛研究相結(jié)合。通過自制脊椎固定裝置建立背根神經(jīng)節(jié)觀察窗，完成背根神經(jīng)節(jié)AAV-CAG-GcaMP6病毒注射，實現(xiàn)了疼痛模型中背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元放電活動的變化。我們發(fā)現(xiàn)足底注射福爾馬林疼痛模型小鼠背根神經(jīng)節(jié)中部分神經(jīng)元放電增快，我們推測該部分神經(jīng)元可能是背根神經(jīng)節(jié)中疼痛相關(guān)神經(jīng)元。
　　結(jié)論: