共培養(yǎng)下內皮祖細胞對背根神經節(jié)細胞影響的實驗研究.pdf

1、目的：⑴分離SD乳鼠背根神經節(jié)，通過Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)高純凈度的背根神經節(jié)細胞，為神經系統(tǒng)疾病相關實驗研究提供實驗基礎。⑵通過梯度密度離心的方法提取骨髓源性單個核細胞，應用EGM-2 MV培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，獲得高純度內皮祖細胞，為內皮系細胞的相關實驗研究提供基礎。⑶通過建立內皮祖細胞與背根神經節(jié)細胞共培養(yǎng)體系，觀察共培養(yǎng)下內皮祖細胞對DRG細胞突起生長的影響，為慢性脊髓損傷修復研究尋求新方向。
　　方法：①選取新生

2、SD大鼠，消毒后在手術放大鏡下摘取背根神經節(jié)，搗碎后用胰蛋白酶消化，終止消化后用含100μg/ml鼠源性神經生長因子、0.1mg/ml L-谷氨酰胺、2％B27添加劑及青鏈霉素的不含血清Neurobasal培養(yǎng)基制成單細胞懸液，接種在提前用多聚賴氨酸包被處理過的6孔細胞培養(yǎng)板內，用Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后全量換成含5μmol/L阿糖胞苷的神經細胞培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，48h后全量換成不含血清的 Neurobasal培養(yǎng)基，

3、之后每2d換液，每天在顯微鏡下觀察細胞生長，取培養(yǎng)第6d的背根神經節(jié)細胞進行NSE免疫組織化學染色以行細胞鑒定。②選取SD大鼠，消毒后在超凈臺內剝離下股骨、脛骨，用Hanks Buffer沖洗髓腔獲得沖洗液，添加淋巴細胞分離液應用梯度密度離心法分離單個核細胞，用內皮系細胞專項培養(yǎng)基（EGM-2 MV）制成單細胞懸液，接種到細胞培養(yǎng)瓶中誘導培養(yǎng)。96h后全量換液，后每3d換液，每日在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。取誘導培養(yǎng)第6d的細胞，應用流式細

4、胞儀對細胞表面抗原CDl33、CD34、VEGFR-2的表達情況進行檢測，同時將培養(yǎng)至7d的細胞爬片通過熒光顯微鏡觀察細胞對 Dil-ac-LDL的攝取及對 FITC-UEA-1的結合能力，即分別從細胞形態(tài)學、細胞表面抗原表達和細胞功能學三個方面鑒定成功誘導培養(yǎng)出高濃度的內皮祖細胞。③分別按照實驗一、二中的步驟進行背根神經節(jié)細胞和內皮祖細胞的培養(yǎng)，實驗組分別選取培養(yǎng)第7d后的內皮祖細胞與培養(yǎng)第4d的背根神經節(jié)細胞分別接種于Transwe

5、ll上、下小室，中間隔以孔徑為0.3μm的聚碳酸脂膜。對照組Transwell上下室接種同實驗組大致等量的背根神經節(jié)細胞。置于同一細胞培養(yǎng)箱中，每2d全量換一次液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察兩組細胞的生長情況。在共培養(yǎng)后第2d、4d對實驗組與對照組的隨機選取10個視野，在倒置相差顯微鏡下進行觀察，通過Image J軟件進行計數(shù)，計算細胞突起的數(shù)量、最長突起長度和平均突起長度。
　　結果：⑴接種后的細胞懸液混濁，內有多量雜質存在。鏡

6、下觀察有神經細胞、成纖維細胞和各種神經膠質細胞等。所有細胞呈圓形、體積較小，接種4h后可見部分細胞開始貼壁，神經細胞胞體的周圍可見光暈。培養(yǎng)24h后細胞幾乎全部貼壁，可見神經節(jié)細胞長出小的突起，可見到數(shù)個神經細胞成島狀存在。培養(yǎng)48h后，神經細胞體積較前變大，不規(guī)則形狀，周圍突起的數(shù)量增加，突起增粗變長。加入阿糖胞苷培養(yǎng)48h后，貼壁的細胞數(shù)明顯減少，可見體積較大的死亡成纖維細胞漂浮存在。繼續(xù)培養(yǎng)，細胞胞體體積逐漸增大，突起變長并增粗，

7、互相連接，神經突起網絡變得稠密。培養(yǎng)第7d，神經節(jié)細胞最為飽滿，突起極為豐富。繼續(xù)培養(yǎng)可見神經節(jié)細胞不再飽滿，胞質減少，突起停止生長，突起逐漸彎曲、回縮，突起之間的連接部分斷裂，培養(yǎng)液中可見漂浮的細胞碎片。培養(yǎng)6d后的細胞行NSE免疫組織化學染色，陽性細胞的細胞質被染成棕褐色。純度檢測結果示，純度可達90%左右。⑵鏡下見剛接種的細胞均呈球形，折光性較強。培養(yǎng)2d后可見部分細胞貼壁，可見少量細胞呈短的梭形。培養(yǎng)4d后，出現(xiàn)細胞突起，突起延

8、伸，偶然可見細胞集落形成，可見部分細胞呈線樣排列。培養(yǎng)7d后可見較多梭形細胞，有較明顯的集落形成，細胞呈典型的線樣排列。第14d可見內皮祖細胞呈多角形，細胞集落之間相互相連，呈典型的鋪路石樣改變。單個核細胞經過EGM-2MV培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)7d后，通過流式細胞儀對細胞表面抗原表達情況進行檢測示：細胞表型表達情況符合已知內皮祖細胞抗原的表達特點。培養(yǎng)第7d的爬片細胞攝取 Dil-Ac-LDL的細胞胞質呈現(xiàn)紅色熒光，攝取FITC-UEA-1的

9、細胞胞質被染成綠色熒光，合成圖像呈雙熒光染色陽性（黃色）的細胞陽性率>70％。雙染陽性細胞陽性為內皮細胞的前體。⑶鏡下見培養(yǎng)1d后，實驗組與對照組相對比背根神經節(jié)細胞胞體折光性較強，突起較多。培養(yǎng)2d、4d后，實驗組與對照組相對比可見背根神經節(jié)細胞突起較長，細胞之間網狀結構更緊密。在細胞共培養(yǎng)的第2d、4d，細胞共培養(yǎng)組中細胞突起的數(shù)量、最長突起和平均突起長度均較對照組有明顯增長，兩組數(shù)據比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

10、　　結論：①摘取新生乳鼠的背根神經節(jié)，用Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過48小時后加入阿糖胞苷來抑制雜志細胞的生長，成功分離培養(yǎng)出了相對純凈度高的背根神經節(jié)細胞。②應用梯度密度離心法提取大鼠骨髓單個核細胞，接種后用EGM-2 MV培養(yǎng)基進行誘導，通過細胞形態(tài)學變化，表面抗原鑒定及細胞功能學鑒定，表明提取的單個核細胞經誘導可以獲得多量高純度的內皮祖細胞。③共培養(yǎng)下EPCs能夠提高背根神經節(jié)細胞突起的生長能力，說明內皮祖細胞對背根神經節(jié)