DC上表達的LSECtin對輔助性T細胞亞群分化的影響及其機制研究.pdf

1、樹突狀細胞(DC)是最重要的抗原提呈細胞，指導CD4+T細胞的活化和分化，參與調節(jié)機體全身免疫反應。當機體受到病原感染時，DC通過其模式識別受體感知外來病原導致其成熟和活化。活化的DC提呈抗原給CD4+T細胞誘導其活化和分化。分化的CD4+T細胞根據其分泌細胞因子的不同可以分為Th1、Th2和Th17細胞亞群。Th1細胞主要分泌IFN-γ保護機體免受胞內病原感染;Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子介導體液免疫抗寄生蟲

2、感染;Th17細胞主要分泌IL-17抵抗胞外真菌感染和參與自身免疫性疾病（如EAE）的發(fā)生發(fā)展。因此分化的CD4+T細胞對于機體抵抗外米病原感染具有十分重要的意義，目前研究的較為清楚的是T細胞內部的信號通路和轉錄因子是如何調節(jié)CD4+T細胞分化的，關于DC如何調控CD4+T細胞分化的分子機制還不是十分清楚。
　　C型凝集素受體(CLRs)是指在其胞外區(qū)含有CRD(carbohydrate recognitiondomain)結構域

3、的一類蛋白分子，主要表達在髓樣細胞，它們在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著多種重要的作用。CLRs可以通過識別真菌細胞壁上的糖基或直接誘導DC胞內信號通路活化或協(xié)同TLRs介導的信號調節(jié)免疫反應?，F(xiàn)在已有的研究證明CLRs主要誘導Th17細胞的分化。
　　LSECtin（肝臟和淋巴結竇內皮細胞粘附分子）是本實驗室從肝臟中發(fā)現(xiàn)的C型凝集素受體。前期研究結果表明:LSECtin特異表達于肝臟的竇內皮細胞（半抗原提呈細胞）和Kupffer細胞（器官特異

4、性巨噬細胞），識別活化T細胞表面的未知配體，負調節(jié)T細胞活化，從而抑制刀豆蛋白A(ConA)誘導的急性肝炎的發(fā)生發(fā)展。這些結果說明LSECtin在肝臟局部免疫反應中發(fā)揮重要作用。肝臟是機體內.的免疫豁免器官，在其內發(fā)生的免疫反應趨向于耐受狀態(tài)，這與以血液和骨髓為主體的全身免疫反應存在不同。由骨髓細胞分化而來的樹突狀細胞在全身免疫反應中發(fā)揮重要作用，是連接天然免疫反應和適應免疫反應的橋梁。
　　本論文中，首先研究在骨髓衍生的樹突狀細

5、胞(BMDC)是否表達LSECtin。實驗結果顯示BMDC上表達LSECtin。在不同時間點應用LPS、IFN-γ、IL-4和TGF-β等不同刺激物處理BMDC，發(fā)現(xiàn)只有TGF-β處理的BMDC在各個時間點均一致性的下調BMDC上LSECtin的轉錄，說明TGF-β負調節(jié)LSECtin的表達。
　　為了進一步研究BMDC上表達LSECtin的功能，我們應用OVA抗原刺激BMDC和T細胞共培養(yǎng)體系。與LSECtin+/+BMDC相比

6、，LSECtin-/-BMDC不影響CD4+T細胞增殖，但是LSECtin-/-BMDC抑制了CD4+T細胞分泌IFN-γ(Th1細胞的標志性細胞因子)和IL-17的分泌（Th17細胞的標志性細胞因子），而促進了IL-13（Th2細胞的標志性細胞因子）的分泌。CD4+T細胞內表達的轉錄因子T-bet、RORγ和RORα、GATA3分別控制IFN-γ、IL-17和IL-13的轉錄。我們的研究發(fā)現(xiàn)LSECtin-/-BMDC顯著抑制T-be

7、t、RORγ和RORα在mRNA水平的轉錄，同時促進GATA3的轉錄。CD4+T細胞表面表達的IL-12受體和IL-6受體/IL-23受體介導的胞內信號通路調節(jié)T-bet、RORγ和RORα的轉錄。發(fā)現(xiàn)LSECtin+/+和LSECtin-/-BMDC的IL-12受體和IL-6受體/IL-23受體的表達不存在差異，說明LSECtin-/-BMDC抑制T-bet、RORγ和RORα的轉錄并不是因為抑制IL-12受體和IL-6受體/IL-2

8、3受體的表達導致的。
　　DC分泌的IL-12p70和IL-6/IL-23分別是誘導CD4+T細胞向Th1和Th17分化的關鍵性細胞因子。研究進一步發(fā)現(xiàn)，在DC和T細胞的共培養(yǎng)體系中，LSECtin缺失后抑制了IL-12p70、IL-6和IL-23分泌。而在共培養(yǎng)體系中添加IL-12p70或IL-6確實能夠挽救由于LSECtin缺失引起的Th1或Th17分化缺陷。
　　BMDC細胞表面表達很多的共刺激分子，其中CD11c、C

9、D40、CD80和MHC-(Ⅱ)(I-A/I-E)的表達對于T細胞的分化非常重要，但是LSECtin+/+和LSECtin-/-BMDC表達的這些共刺激分子并沒有差異。此外，在OVA抗原刺激下，LSECtin+/+和LSECtin-/-BMDC分泌的細胞因子也并沒有差異。而且與共培養(yǎng)體系相比，OVA抗原刺激BMDC后細胞因子的分泌量也非常低。因此，實驗結果說明在共培養(yǎng)體系中，LSECtin促進IL-12p70、IL-6和IL-23的分泌

10、依賴于CD4+T細胞的存在。前期研究結果表明，CD4+T細胞表面有LSECtin的未知配體，所以這些結果強烈暗示T細胞表面的LSECtin內源性配體，通過LSECtin反向作用于DC，促進DC分泌細胞因子，從而誘導Th1和Th17細胞的分化。
　　為了證實這個假設，應用LSECtin不同的單克隆抗體(CCA023、CFD051和CCB059)模擬LSECtin的配體刺激DC。LSECtin單克隆抗體CCA023、CFD051和CC

11、B059分別識別LSECtin的跨膜區(qū)、脖子區(qū)和糖基識別結構域(CRD)。研究發(fā)現(xiàn)只有CFD051刺激DC后能夠誘導細胞因子TNF-α的分泌，說明LSECtin能夠誘導DC分泌細胞因子，并且特異的被識別脖子區(qū)的CFD051抗體所觸發(fā)。為了進一步研究LSECtin對DC功能的影響，DC分別接受培養(yǎng)基培養(yǎng)、mIgG1同型對照和CFD051抗體刺激，12h后，發(fā)現(xiàn)051抗體刺激后MDDC的樹突樣結構明顯增加，這說明LSECtin誘導DC成熟（

12、形態(tài)學水平）。為了進一步在分子水平驗證LSECtin促進DC成熟，分別應用mlgG1同型對照、CFD051抗體和LPS刺激（陽性對照）DC，24h后，檢測共刺激分子HLA-DR、CD83和CD86的表達。發(fā)現(xiàn)CFD051抗體刺激后，這些DC的共刺激分子表達明顯上調，因此可以證實LSECtin促進DC成熟。此外，更重要的是我們需要證明DC上表達的LSECtin促進細胞因子的分泌，例如IL-6。應用不同濃度的mIgG1同型對照和CFD051

13、抗體刺激DC，24h后，ELISA檢測細胞因子IL-6和IL-10分泌。發(fā)現(xiàn)CFD051抗體促進DC分泌IL-6和IL-10，并且分泌量與LSECtin的抗體濃度呈現(xiàn)劑量依賴性。同樣，應用相同濃度的mIgG1同型對照和CFD051抗體處理DC，在不同時間點收獲DC，檢測CFD051抗體對細胞因子IL-6、TNF-α和IL-10轉錄的影響。發(fā)現(xiàn)在3h時，CFD051抗體誘導細胞因子IL-6、TNF-α和IL-10轉錄達到高峰。總之，以上這

14、些結果充分說明DC上表達的LSECtin通過與LSECtin單克隆抗體CFD051的結合促進DC的成熟和分泌細胞因子，暗示CFD051是通過誘導LSECtin胞內信號的活化影響DC的功能。
　　為了研究LSECtin介導胞內信號轉導活化的機制，首先分析了LSECtin的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在其胞內并不存在信號轉導所需的ITAM基序(immunoreceptor tyrosine-based activatory motif)，但是在靠

15、近其跨膜區(qū)附近有一段富含帶正電荷的氨基酸序列WXYWXYWXYY（X代表任意氨基酸，Y代表帶正電荷氨基酸）。帶正電荷的氨基酸可以與帶有負電荷的接頭蛋白(DAP12和FceRIg)相互作用，傳遞信號。通過免疫共沉淀實驗，我們證明LSECtin不與接頭蛋白分子FceRIg存在相互作用，但是與DAP12存在相互作用，而且這種相互作用依賴于LSECtin的跨膜區(qū)。此外通過慢病毒感染Jurkat細胞共轉LSECtin和DAP12，我們發(fā)現(xiàn)DAP1

16、2促進LSECtin細胞表面的穩(wěn)定表達，初步說明LSECtin和DAP12的相互作用是功能性的。上述結果提示LSECtin可能通過與DAP12相互作用，借助DAP12胞內區(qū)的ITAM基序（免疫酪氨酸活化基序）誘導胞內信號的發(fā)生。
　　綜上所述，研究結果顯示:T細胞表面的LSECtin未知配體作用于DC上的LSECtin，通過DAP12誘導胞內信號的發(fā)生，促進IL-12p70和IL-6/IL-23等細胞因子的分泌，進而誘導初始CD4