濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞在重癥肌無(wú)力發(fā)病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、重癥肌無(wú)力（Myasthenia gravis，MG）是由乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）抗體介導(dǎo)的神經(jīng)肌肉接頭處獲得性自身免疫性疾病。目前普遍認(rèn)為：胸腺在MG的發(fā)生、發(fā)展以及疾病的維持中扮演著重要的角色。80％的MG患者合并有胸腺異常，包括胸腺增生和胸腺瘤，此外，H&E染色發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺中有B細(xì)胞增生形成的異位生發(fā)中心（germinal centers，GCs）。濾泡輔助性T（T follicu

2、lar helper，Tfh）細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)重要亞群，在B細(xì)胞成熟、抗體產(chǎn)生、GC形成中發(fā)揮著極其重要的作用。研究表明 Tfh細(xì)胞及其相關(guān)的效應(yīng)分子在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為數(shù)量增加或者功能異常。有研究顯示 MG患者外周血中 Tfh細(xì)胞比例增加，但是 MG患者胸腺中是否也有 Tfh細(xì)胞比例的變化以及 Tfh對(duì)胸腺B細(xì)胞的輔助及異位GC形成中的作用目前尚不清楚。因此，我們的目的是通過(guò)研究MG患者外周血和胸腺中

3、的Tfh細(xì)胞比例的變化，及其與抗AChR抗體水平之間的關(guān)系，以及Tfh和B細(xì)胞之間的相互作用，探索Tfh細(xì)胞在抗體產(chǎn)生、異位GC形成及MG發(fā)病中的作用。
　　方法：
　　從唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收集113例MG患者的外周血，其中眼肌型MG（Ocular MG，OMG）34例，全身型MG（Generalized MG，GMG）79例，同時(shí)收集20例年齡、性別相匹配的健康對(duì)照者（Healthy controls，HC）和9例單純的胸腺

4、瘤不合并MG（Non-MG-associated thymomas，NMG）患者為對(duì)照組。另外，我們還從唐都醫(yī)院胸外科收集28例合并胸腺異常的MG患者的胸腺組織以及外周血，其中OMG9例，GMG19例。同時(shí)還收集8例單純胸腺瘤患者的胸腺組織標(biāo)本以及從西京醫(yī)院心臟外科獲得9例正常胸腺作為對(duì)照組。分別采用密度梯度離心和機(jī)械分離的方法從外周血和新鮮的胸腺組織中分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear

5、cells，PBMCs）和胸腺細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè) MG患者和對(duì)照組的外周血和胸腺組織中的Tfh和B細(xì)胞的比例；采用放免的方法檢測(cè)患者血清和胸腺組織上清中抗 AChR抗體的滴度，并且分析其與Tfh和B細(xì)胞的比例的相關(guān)性；通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)PBMCs和胸腺組織中Tfh、Th1以及Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6、T-bet、以及GATA-3 mRNA的表達(dá)水平；分別采用了RT-PCR，Western Blotting以及EL

6、ISA的方法檢測(cè)了PBMCs和胸腺組織中Tfh、Th1以及Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-21、IFN-γ以及IL-4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步研究Tfh在AChR抗體產(chǎn)生及 MG病理過(guò)程中的作用，我們采用免疫磁珠分選的方法，從 GMG患者和健康對(duì)照者的PBMCs中分選純化Tfh和B細(xì)胞，單獨(dú)或者共同培養(yǎng)7天后，檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗AChR抗體滴度和IL-21水平；同時(shí)我們還采用活細(xì)胞工作站的方法，動(dòng)態(tài)觀察了Tfh和B細(xì)胞之間的相互作用

7、。此外，我們還通過(guò)免疫熒光染色、共聚焦熒光顯微鏡觀察MG患者胸腺組織中的異位GC以及Tfh與B細(xì)胞的共定位。另外，我還隨訪了28例胸腺切除后的MG患者，分析了他們術(shù)后疾病的轉(zhuǎn)歸情況，并且收集了3例術(shù)后復(fù)發(fā)的MG患者的骨髓，采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)了骨髓中AChR特異性的長(zhǎng)壽漿細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：
　　MG患者外周血及胸腺組織中CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞（Tfh細(xì)胞）和B細(xì)胞的比例較對(duì)照組均顯著增高，并且GMG患

8、者顯著高于OMG患者，同時(shí)GMG患者血清以及胸腺組織上清中的抗AChR抗體滴度也顯著高于OMG和對(duì)照組，但是OMG和對(duì)照組之間比較無(wú)差異；相關(guān)性分析提示：Tfh細(xì)胞的比例與患者QMG評(píng)分和抗AChR抗體滴度水平均呈正相關(guān)；Tfh細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 Bcl-6和細(xì)胞因子 IL-21的表達(dá)在OMG和GMG患者的外周血以及胸腺中表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，此趨勢(shì)在GMG患者組中更為明顯，但是Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3和細(xì)

9、胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)在各組之間沒(méi)有差異；體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：GMG患者外周血的B細(xì)胞單獨(dú)、與自身的Tfh細(xì)胞或者與健康對(duì)照的Tfh細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)上清中均能檢測(cè)到抗AChR抗體，并且在GMG患者的B細(xì)胞與自身的Tfh細(xì)胞培養(yǎng)上清中AChR抗體滴度顯著高于其他組；同時(shí)，GMG患者Tfh細(xì)胞與自身的B細(xì)胞和GMG患者Tfh細(xì)胞與健康對(duì)照的B細(xì)胞培養(yǎng)的上清中有較高水平的IL-21，并且前者顯著高于后者；活細(xì)胞工作站也動(dòng)態(tài)觀

10、察了Tfh和B細(xì)胞相互作用的過(guò)程；激光共聚焦結(jié)果提示：MG患者胸腺組織中存在異位 GC，并且異位 GC內(nèi)發(fā)現(xiàn)有CD4+CXCR5+Tfh的分布，同時(shí)觀察到Tfh與B細(xì)胞在空間上有相互接觸、相互作用的區(qū)域；對(duì)切除胸腺的MG患者隨訪結(jié)果顯示：MG患者在術(shù)后1個(gè)月時(shí)，外周血中Tfh、B細(xì)胞以及抗AChR抗體水平較術(shù)前降低，但是在疾病復(fù)發(fā)后又均升高，甚至超過(guò)術(shù)前的水平，并且發(fā)現(xiàn)胸腺切除術(shù)后復(fù)發(fā)的MG患者骨髓中存在AChR特異性長(zhǎng)壽漿細(xì)胞，而健康

11、的對(duì)照者骨髓中幾乎沒(méi)有，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果提示：MG患者外周血以及胸腺中的 Tfh細(xì)胞可能參與了MG的病理過(guò)程。同時(shí)，MG患者胸腺中的Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用可能促進(jìn)了異位GC的形成和抗AChR抗體的產(chǎn)生，這可能是MG始動(dòng)以及維持的主要原因。因此對(duì)Tfh細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控或特異性阻斷Tfh-B細(xì)胞的相互作用有可能成為MG治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。此外，胸腺切除術(shù)后疾病復(fù)發(fā)的MG患者骨髓中檢測(cè)出AC