BMP-2-Noggin相互作用對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，占口腔頜面部惡性腫瘤的45.9％。舌癌病因至今不明，普遍認(rèn)為是“癌瘤病因綜合作用的”結(jié)果。因此，研究舌癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及治療方法具有重要意義。隨著近年來分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為舌癌的發(fā)生是一個(gè)由多個(gè)基因和細(xì)胞因子參與介導(dǎo)的過程，近年研究發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白及其信號(hào)通路在舌癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
　　 骨形成蛋白2(Bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)

2、是調(diào)節(jié)骨形成的重要的因子，它在骨骼的胚胎發(fā)育、再生修復(fù)中起著重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2影響不同惡性腫瘤細(xì)胞增殖、形成和轉(zhuǎn)移，具有調(diào)節(jié)惡性腫瘤的生物學(xué)行為的作用[1]。Noggin基因?qū)w內(nèi)骨骼、神經(jīng)等多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育和/或重塑起著重要的調(diào)控作用。Noggin蛋白是一種BMP-2的細(xì)胞外拮抗劑，它可以與BMP-2特異性地結(jié)合，阻止BMP-2與其細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而抑制BMP-2生物學(xué)功能的發(fā)揮。Noggin和BMP-2的相互調(diào)節(jié)

3、在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，通過調(diào)節(jié)Noggin和BMP-2的相互作用治療相關(guān)疾病，成為現(xiàn)在研究的一個(gè)方向。本課題旨在研究外源性BMP-2、BMP-2/Noggin相互作用對(duì)舌癌細(xì)胞的增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制，從而為表達(dá)BMP-2腫瘤的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的
　　 研究外源性BMP-2及BMP-2/Noggin相互作用對(duì)舌癌細(xì)胞增殖的影響及BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化。
　　

4、 方法
　　 1、舌癌細(xì)胞培養(yǎng):體外培養(yǎng)舌癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及增殖活性。
　　 2、外源性BMP-2對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活性及BMP/Smad信號(hào)通路的影響:用不同濃度的BMP-2蛋白(0，20，40，60，80，100ng/ml)作用于體外培養(yǎng)的舌癌細(xì)胞，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)的變化情況，分別于培養(yǎng)后1，2，3，4，5，6d用甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)BMP-2對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活

5、性的影響以及其與劑量和時(shí)間的關(guān)系。Westernblot分別檢測(cè)2d，4d時(shí)不同BMP-2濃度（40，80ng/ml）下BMPRⅡ、Smad4蛋白的變化。
　　 3、Noggin蛋白對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活性及BMP/Smad信號(hào)通路的影響:將傳代后細(xì)胞加入含40ng/mlBMP-2的培養(yǎng)液中，細(xì)胞貼壁24h后，分別加入Noggin蛋白，使培養(yǎng)液的Noggin蛋白濃度分別為0，100，200，300，400，500ng/ml，分別于培養(yǎng)

6、后1，2，3，4，5，6d用MTT法檢測(cè)Noggin和BMP-2的相互作用對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活性的影響。WestemBlot分別檢測(cè)2d，4d不同Noggin蛋白濃度(200，400ng/ml)下BMPRⅡ、Smad4蛋白的變化。
　　 結(jié)果
　　 1、舌癌細(xì)胞培養(yǎng):
　　 舌癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)良好，單個(gè)細(xì)胞呈三角形或長(zhǎng)梭形，立體感不強(qiáng)。集落性生長(zhǎng)，增殖較快，約第2天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4天進(jìn)入平臺(tái)期。<

7、br>　　 2、外源性BMP-2對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活性及BMP/Smad信號(hào)通路的影響:BMP-2蛋白抑制舌癌細(xì)胞的增殖，隨濃度增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，80ng/ml時(shí)抑制作用較強(qiáng)，100ng/ml時(shí)趨于穩(wěn)定。隨BMP-2蛋白濃度和時(shí)間的增加，BMPRⅡ、Smad4蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。
　　 3、Noggin蛋白對(duì)舌癌細(xì)胞增殖活性及BMP/Smad信號(hào)通路的影響:Noggin蛋白促進(jìn)舌癌細(xì)胞的增殖，隨濃度增加促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，400

8、ng/ml時(shí)促進(jìn)作用較強(qiáng)，500ng/ml時(shí)趨于穩(wěn)定。隨Noggin蛋白濃度和時(shí)間的增加，BMPRⅡ、Smad4蛋白的表達(dá)逐漸減弱。
　　 結(jié)論
　　 1、MTT檢測(cè)顯示外源性BMP-2蛋白抑制舌癌細(xì)胞的增殖，此抑制作用有時(shí)間和劑量依賴性，通過WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMP-2對(duì)舌癌細(xì)胞抑制作用越強(qiáng)，BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)也越強(qiáng)。說明BMP-2可能通過BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控舌癌細(xì)胞的增殖。