熊果酸對(duì)人舌癌Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、口腔癌是最常見(jiàn)的十大惡性腫瘤之一,而在我國(guó)口腔癌中,舌癌的發(fā)病率居第一位。舌癌生長(zhǎng)快,惡性程度高,浸潤(rùn)性較強(qiáng)。治療方法常是手術(shù)、放療、化療等的綜合治療,但患者的五年生存率仍然很低,探尋積極有效的預(yù)防途徑及有效的治療藥物顯得十分迫切和必要。
　　 熊果酸對(duì)多種致癌、促癌物有抵抗作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡。而熊果酸對(duì)口腔腫瘤的作用研究較少,而其對(duì)舌癌作用機(jī)制的研究,國(guó)內(nèi)外尚不多見(jiàn)。
　　 采用

2、體外培養(yǎng)人舌癌Tca8113細(xì)胞的方法,觀察熊果酸對(duì)其產(chǎn)生的作用。在此基礎(chǔ)上,采用MTT法,流式細(xì)胞術(shù)、電鏡觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、及RT—PCR、Western Blot等多種分子生物學(xué)技術(shù)觀察熊果酸對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡的影響并探討其發(fā)生機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以Tca8113細(xì)胞株建立人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型,應(yīng)用適當(dāng)濃度的熊果酸進(jìn)行治療,觀察熊果酸經(jīng)體內(nèi)代謝后對(duì)腫瘤的影響以及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng),并探討其發(fā)生機(jī)制,為舌癌

3、的治療尋找新的藥物,拓展新的思路和方法,為熊果酸在口腔癌治療中的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為以下三個(gè)部分:
　　 方法:
　　 1.光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)和經(jīng)熊果酸作用的Tca8113細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 2.經(jīng)濃度為6.25、12.5、25、50μmol／L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞,分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72h后,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyl ter

4、azolium,MTT)比色法,檢測(cè)Tca8113細(xì)胞增殖活性的改變,觀察不同濃度熊果酸作用不同時(shí)間后對(duì)人舌癌Tca8113的毒性效應(yīng)。
　　 3.將濃度25μmol／L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞,分別培養(yǎng)0、24、48、72h后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometer,FCM)在功能水平上檢測(cè)人舌癌Tca8113細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期分布情況。
　　 4.應(yīng)用透射電鏡觀察經(jīng)25μmol／L熊果酸作

5、用72h的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。MTT法檢測(cè)結(jié)果采用兩因素方差分析,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)熊果酸作用后的Tca8113細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化。
　　 2.熊果酸對(duì)Tca8113細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性；不同

6、濃度組間、不同時(shí)間組間生長(zhǎng)抑制率均有顯著性差異(P<0.01)。50μmol／L熊果酸作用72h后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)68.80％。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,隨熊果酸作用時(shí)間延長(zhǎng),Tca8113細(xì)胞凋亡率由2.57％增加至24.51％,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。G2／M期細(xì)胞比例變化不明顯(P>0.05),而S期細(xì)胞比例逐漸降低(P<0.01),G0／G1期細(xì)胞比率明顯升高(P<0.01)。
　　 4.透射電鏡顯示

7、熊果酸作用后,細(xì)胞骨架破壞,核染色質(zhì)濃縮成塊,同時(shí)可見(jiàn)凋亡小體。
　　 方法:
　　 1.分別制作經(jīng)濃度25μmol／L熊果酸作用0、24、48、72h的細(xì)胞爬片,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞NF-κB、VEGF、bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)情況。
　　 2.將25μmol／L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞0、24、48、72h后,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription—po

8、lymerase chainreaction,RT—PCR)技術(shù)檢測(cè)藥物作用后的Tca8113細(xì)胞中NF—κB、VEGF、bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)情況,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細(xì)胞增殖及其促其凋亡的機(jī)制。
　　 3.將25μmol／L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細(xì)胞0、24、48、72h后,采用Western Blot方法檢測(cè)藥物作用后的Tca8113細(xì)胞中NF-κB、VEGF、Bcl-2和

9、Bax基因蛋白表達(dá)情況,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析,進(jìn)一步研究熊果酸抑制舌癌細(xì)胞增殖及其促其凋亡的機(jī)制。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果:NF-κB棕黃色著色在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)；VEGF棕黃色著色在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；Bcl-2、Bax棕黃色顆粒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

10、
　　 2.RT-PCR結(jié)果:經(jīng)熊果酸作用后,Tca8113細(xì)胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2基因mRNA表達(dá)逐漸降低,Bax細(xì)胞因子mRNA表達(dá)逐漸升高,Bcl-2／Bax比例降低,且有時(shí)間依賴性。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.Western blot檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)熊果酸作用后,Tca8113細(xì)胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白表達(dá)逐漸降低,Bax蛋白表達(dá)逐漸升高,且有時(shí)間依賴性。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P<0.05)。
　　 方法:
　　 1.選用4-6w齡的BALB／C-nu／nu雌性裸小鼠12只,在其腋部皮下接種Tca8113細(xì)胞,建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組6只,實(shí)驗(yàn)組每d向腫瘤組織局部注射熊果酸,劑量為0.05mg／g體質(zhì)量；對(duì)照組注射同體積PBS(0.01M,pH7.4)。共治療4w。
　　 2.每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動(dòng)狀況。每w測(cè)量瘤體大小及裸鼠體重,進(jìn)行藥物毒性評(píng)價(jià)

12、。
　　 3.治療結(jié)束時(shí)處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計(jì)算抑瘤率。
　　 4.光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織及腦、心、肝、脾、腎等重要臟器。
　　 5.應(yīng)用RT—PCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤中NF—κB、VEGF、bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)情況,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細(xì)胞移植瘤機(jī)制。
　　 6.采用Western Blot方法檢測(cè)移植瘤中NF-κB、VEGF、Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)情

13、況,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析,進(jìn)一步研究熊果酸抑制舌癌細(xì)胞移植瘤增殖及其促其凋亡的機(jī)制。
　　 7.采用TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡情況,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。裸鼠體質(zhì)量變化及瘤體質(zhì)量變化分別采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。RT—PCR及Western Blot采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

14、>　　 結(jié)果:
　　 1.與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)緩慢,隨注射熊果酸時(shí)間增長(zhǎng),腫瘤被抑制效果更加明顯。到治療結(jié)束時(shí),兩組裸鼠移植瘤體積、瘤質(zhì)量均存在顯著性差異(P<0.05)。瘤質(zhì)量及瘤體積抑制率達(dá)到55.65％和61.72％。
　　 2.治療過(guò)程中,裸鼠未見(jiàn)明顯不良反應(yīng),治療結(jié)束時(shí),各組裸鼠體質(zhì)量與治療前體質(zhì)量相比增加平穩(wěn),比值大于0.8,未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)。兩組裸鼠的重要臟器腦、心、肝、脾、腎等均未見(jiàn)器質(zhì)性改變及

15、瘤轉(zhuǎn)移等。
　　 3.光學(xué)顯微鏡下,實(shí)驗(yàn)組腫瘤內(nèi)組織壞死崩解的面積明顯大于對(duì)照組,細(xì)胞形態(tài)的異形性比對(duì)照組小,可見(jiàn)核固縮等凋亡現(xiàn)象。
　　 4.RT—PCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤中NF—κB、VEGF、bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào),Bax mRNA表達(dá)上調(diào),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 5.Western Blot方法檢測(cè)移植瘤中NF—κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白下調(diào),Bax基因蛋白表達(dá)上調(diào),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

16、P<0.05)。
　　 6.與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞明顯增多,兩組AI分別為:1.63±0.30.17.39±2.78,組間有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究前兩部分采用MTT方法、流式細(xì)胞術(shù)及電鏡技術(shù)檢測(cè)熊果酸對(duì)人舌癌Trca8113細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、RT—PCR技術(shù)以及Western Blot免疫印跡等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)了熊果酸對(duì)人舌癌

17、Tca8113細(xì)胞基因NF—κB、VEGF、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達(dá)的影響。第三部分采用上述部分方法進(jìn)行熊果酸作用后的Tca8113裸鼠移植瘤的檢測(cè),得出如下結(jié)論:
　　 1.熊果酸對(duì)人舌癌Tca8113細(xì)胞具有增殖抑制作用,并且呈時(shí)間劑量依賴性。
　　 2.熊果酸對(duì)人舌癌Tca8113細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用,并且存在時(shí)間依賴性。
　　 3.熊果酸能下調(diào)人舌癌Tca8113細(xì)胞的NF—κB、VEGF、

18、Bcl-2 mRNA以及蛋白表達(dá),能上調(diào)Bax表達(dá),改變了Bcl-2／Bax的比例,且具有時(shí)間依賴性。此作用可能是其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　 4.熊果酸參與Tca8113細(xì)胞周期調(diào)控,使細(xì)胞阻滯于G0／G1期。熊果酸對(duì)細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及相關(guān)基因的抑制作用可能均與其G0／G1期阻滯有關(guān)。
　　 5.成功構(gòu)建了人舌癌Tca8113細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,證實(shí)熊果酸能抑制舌癌移植瘤生長(zhǎng),且對(duì)機(jī)體無(wú)明顯毒、副作用。