EphA2促進胃癌SGC7901-AGS細胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的信號通路研究.pdf

1、背景:
　　侵襲轉(zhuǎn)移是進展期胃癌患者死亡的主要原因，因此對進展期胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究具有重要的意義。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelialmesenchymal transition，EMT)是多種實體性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的早期關(guān)鍵事件，也是近年來研究的熱點。目前的研究發(fā)現(xiàn)多種通路參與了惡性腫瘤的EMT，包括Wnt、Notch、TGF-β及MAPK等。Eph受體家族(erythropoietin-producing hepatoc

2、ellular receptors)是現(xiàn)已知的受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTKs）家族中最大的亞家族，在哺乳動物中共有14個成員，是調(diào)控腫瘤細胞增殖、生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。EphA2受體是其中一員，其編碼基因定位于腫瘤“熱點”的染色體區(qū)域1p36.1，在多種腫瘤呈高表達和高度異?；罨?，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和治療預(yù)后相關(guān)。我們的前期研究顯示胃癌中EphA2可能參與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移，但EphA2調(diào)控胃癌E

3、MT的通路機制尚未見報道。
　　目的:
　　探討EphA2在胃癌EMT中的作用及其涉及的信號通路。
　　方法:
　　1、采用免疫組化法檢測115例胃癌患者癌組織和癌旁正常粘膜組織中EphA2、E-cadherin、Snai1、N-cadherin和β-catenin的表達情況。
　　2、構(gòu)建特異性EphA2 siRNA載體和EphA2過表達載體，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到胃癌SGC7901和AGS細胞。MTT法觀

4、察細胞生長，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，顯微鏡下觀察細胞形狀的變化，劃痕試驗和Transwell試驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。并用Realtime RT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測EMT特征性分子(Snai1、N-cadherin、E-cadherin)的表達情況。
　　3、用Wnt/β-catenin通路特異性抑制劑XAV-939處理SGC7901、AGS胃癌細胞及已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EphA2過表達載體的上述兩株胃

5、癌細胞。用Real time RT-PCR檢測β-catenin mRNA表達變化，Western blot、免疫熒光法檢測β-eatenin、GSK-3β及p-GSK-3βSer9蛋白表達變化、MTT法觀察細胞生長，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，顯微鏡下觀察細胞形狀的變化，劃痕試驗和Transwell試驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。并用Real time RT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測EMT特征性分子(Snai1、

6、N-cadherin和E-cadherin)及Wnt/β-catenin通路靶基因c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達情況。
　　4、用Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl處理GC7901、AGS胃癌細胞及已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EphA2 siRNA的上述兩株胃癌細胞。用Real timeRT-PCR檢測β-catenin mRNA表達變化，Western blot、免疫熒光法檢測β-catenin、GSK-3β及p-GSK

7、-3βSer9蛋白表達變化、MTT法觀察細胞生長，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，顯微鏡下觀察細胞形狀的變化，劃痕試驗和Transwell試驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。并用Realtime RT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測E-cadherin、Snai1、N-cadherin、c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、與癌旁非癌胃粘膜組織相比，胃癌組織的EphA2、Snai1

8、和N-cadherin明顯高表達，β-catenin核表達明顯增多，E-cadherin明顯低表達。胃癌組織中EphA2表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)及TNM分期相關(guān);Snai1的表達與胃癌的浸潤深度、TNM分期相關(guān);N-cadherin的表達與胃癌的浸潤深度相關(guān);E-cadherin的表達與胃癌的浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)相關(guān);β-catenin的核表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)有關(guān)。Eph

9、A2與Snai1、N-cadherin的表達呈正相關(guān)，與E-cadherin的表達呈負相關(guān)，與β-catenin的核表達呈正相關(guān)。
　　2、EphA2過表達促進胃癌細胞增殖，細胞周期分布發(fā)生變化，S期和G2/M期比例增高，而G0/G1期比例降低，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。EphA2被siRNA抑制后細胞生長明顯抑制，細胞周期發(fā)生變化，G0/G1期比例增高，而S期和G2/M期比例降低，細胞的遷移和侵襲能力明顯降低。顯微鏡下可見，

10、EphA2過表達之后，胃癌細胞（AGS和SGC7901）呈細長、錐形改變，失去片狀圓形上皮樣細胞形態(tài)。EphA2過表達顯著降低了E-cadhrin的表達水平，并使Snai1及N-cadherin的表達水平升高;抑制EphA2后則使E-cadherin表達升高，Snai1及N-cadherin表達降低。
　　3、Wnt/β-catenin通路特異性抑制劑XAV939能明顯下調(diào)EphA2及p-GSK-3βSer9的表達，抑制SGC79

11、01和AGS細胞β-catenin核轉(zhuǎn)移，抑制細胞生長;S期和G2/M期細胞減少，G0/G1期細胞增多，細胞侵襲能力下降;Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達下調(diào);Snai1、N-cadherin表達降低，E-cadherin的表達升高。同時EphA2過表達加入XAV-939后，能部分逆轉(zhuǎn)EphA2過表達對于胃癌細胞增殖、侵襲及EMT的促進作用。
　　4、Wnt/β-catenin

12、通路特異性激活劑LiCl能明顯上調(diào)EphA2及p-GSK-3βSer9的表達，促進SGC7901和AGS細胞β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移，促進細胞生長;S期和G2/M期細胞增多，G0/G1期細胞減少，細胞侵襲能力增強;Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達升高;Snai1、N-cadherin的表達升高，E-cadherin的表達下調(diào)，細胞形態(tài)呈明顯EMT變化。但是，同時EphA2沉默表達