基于引經(jīng)理論探討麝香促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的信號(hào)通路研究.pdf

1、目的：通過麝香含藥血清干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs），擬從信號(hào)通路入手進(jìn)行研究，探討信號(hào)通路與干細(xì)胞遷移學(xué)說及中醫(yī)引經(jīng)理論的相關(guān)性，為研究引經(jīng)藥提供了新思路，為其遷移機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：通過給大鼠灌服高、中、低劑量的麝香并制備不同濃度含藥血清，以灌服等體積生理鹽水制備的血清作為空白對(duì)照組。采用貼壁篩選法體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)至第三代，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表

2、面抗原，經(jīng)過成骨成脂誘導(dǎo)鑒定認(rèn)為培養(yǎng)BMSCs成功后，利用制備的不同濃度麝香含藥血清的5％濃度含藥血清干預(yù)第三代BMSCs，利用MTT法檢測(cè)BMSCs增殖情況，成骨誘導(dǎo)后進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）定性、定量檢測(cè)，I-型膠原免疫熒光染色，測(cè)定鈣化結(jié)節(jié)數(shù)。通過加入不同信號(hào)通路阻斷劑利用Transwell小室檢測(cè)BMSCs細(xì)胞遷移率變化，比較不同時(shí)間段各組間、組內(nèi)差異，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而探討不同濃度麝

3、香對(duì)大鼠BMSCs增殖、成骨分化等的影響，同時(shí)探討不同濃度麝香介導(dǎo)信號(hào)通路對(duì)BMSCs遷移影響。
　　結(jié)果：采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs呈梭形或旋渦狀，貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好、純度較高、活力較好；表型鑒定結(jié)果顯示P3代BMSCs中CD45和CD34為陰性抗原，CD44和CD90為陽(yáng)性抗原；加入成骨、成脂誘導(dǎo)劑后，BMSCs可定向成骨、成脂分化；MTT結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，第1天中濃度麝香組促進(jìn)BMSCs增殖顯著（P＜

4、0.05），其余各時(shí)間段以低濃度麝香組促進(jìn)BMSCs增殖作用最強(qiáng)（P＜0.05），不同時(shí)間段組內(nèi)比較無差異（P＞0.05）；不同濃度組麝香在不同時(shí)間段均能促進(jìn)BMSCs成骨性分化，具體有：（1）與對(duì)照組比較，各誘導(dǎo)組在不同時(shí)間段均能提高ALP活性及染色陽(yáng)性數(shù)(P＜0.05)，以低濃度組影響較顯著（P＜0.01），不同時(shí)間段組內(nèi)比較無差異(P＞0.05)；（2）與對(duì)照組比較，不同濃度麝香組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增加(P＜0.05)，以低濃度麝香

5、組顯著（P＜0.01）；（3）與對(duì)照組比較，不同濃度麝香組對(duì)Ⅰ-型膠原陽(yáng)性表達(dá)明顯提高(P＜0.05)，以低濃度麝香組顯著（P＜0.01）；在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）與對(duì)照組比較，不同濃度麝香在24h、48h、72h均增加BMSCs遷移（P＜0.05），麝香促BMSCs遷移效應(yīng)與濃度呈負(fù)相關(guān)、與時(shí)間呈正相關(guān)，以低濃度組效果最好（P＜0.01），不同時(shí)間段組內(nèi)比較無差異（P＞0.05）；（2）加入阻斷劑PD98059后顯

6、示，與對(duì)照組比較，低濃度麝香組在不同時(shí)間段增加BMSCs遷移數(shù)量（P＜0.05），低濃度麝香組+PD干預(yù)組隨著時(shí)間延長(zhǎng)其遷移數(shù)量明顯減少，不同時(shí)間段組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（3）加入阻斷劑GF109203X后顯示，與對(duì)照組比較，低濃度麝香組在24h、48h、72h促BMSCs遷移數(shù)量明顯增加（P＜0.05），低濃度麝香組+GF干預(yù)組其遷移數(shù)量不同時(shí)間段明顯減少，不同時(shí)間段組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（4）加

7、入阻斷劑LY294002后顯示，與對(duì)照組比較，低濃度麝香組促BMSCs遷移數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加（P＜0.05），低濃度麝香組+LY干預(yù)組其遷移數(shù)量與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。說明麝香促BMSCs遷移的機(jī)制與活化MAPK/ERK1/2、PKC、PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論：麝香可促進(jìn)BMSCs增殖，并參與成骨分化過程；麝香可促進(jìn)外源性BMSCs遷移，其機(jī)制可能與MAPK/ERK1/2、PI3K/AKT及PKC通路活化有關(guān)，該途徑對(duì)麝