EphA2與胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞EMT關(guān)系的初步研究.pdf

1、背景:
　　胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，化療作為胃癌術(shù)后最有效的輔助治療手段之一，在防治胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移方面的作用舉足輕重。奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)是繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑類(lèi)抗癌藥，已逐漸成為治療進(jìn)展期胃癌的主要藥物，并顯示出良好的應(yīng)用前景，但部分胃癌患者仍表現(xiàn)出對(duì)鉑類(lèi)化療藥物耐藥。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)被認(rèn)為是誘發(fā)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)

2、移的早期關(guān)鍵事件，而近幾年的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中EMT的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有密切關(guān)系。一種觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為已發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性降低。另一種觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為當(dāng)腫瘤細(xì)胞通過(guò)逐漸誘導(dǎo)的方法建立耐藥細(xì)胞株往往會(huì)發(fā)生EMT;而逆轉(zhuǎn)EMT，能夠增加耐藥細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性。這種由于腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT而獲得的耐藥性，成為后期治療的難題，因此研究腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生與耐藥的關(guān)系對(duì)于腫瘤治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。我們前期關(guān)于EphA2在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥

3、機(jī)制方面的研究發(fā)現(xiàn)，將pEGFP-N1-CMV-EphA2慢病毒過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入胃癌SGC-7901細(xì)胞后，EphA2過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞獲得間質(zhì)樣表型，侵襲能力更強(qiáng)，EMT核轉(zhuǎn)錄因子Snail、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin和Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子β-catenin、TCF-4、cyclinD1蛋白水平上調(diào)，而上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin蛋白水平下降，提示EphA2可能通過(guò)Wnt/β-catenin通路調(diào)控胃癌細(xì)

4、胞EMT的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)EphA2過(guò)表達(dá)組胃癌細(xì)胞對(duì)不同濃度的奧沙利鉑敏感性均降低，說(shuō)明EphA2在胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步揭示EphA2在胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生和耐藥中的作用，本研究建立人胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP，研究其細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)以及靶向沉默EphA2在SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中的表達(dá)能否逆轉(zhuǎn)其EMT發(fā)生從而影響其對(duì)奧沙利鉑的敏感性。
　　目的:初步探討EphA2與胃

5、癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞EMT關(guān)系。
　　方法:
　　人胃癌SGC-7901細(xì)胞在1640培養(yǎng)液中，37℃、5％的CO2飽和濕度下培養(yǎng)，用0.25％的胰蛋白酶消化傳代;采用逐步遞增濃度間歇誘導(dǎo)法建立人胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP;應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀(guān)察耐藥細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)改變;通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，根據(jù)公式:Td(h)=T×[log2/(logN-logN0)]，計(jì)算耐藥細(xì)胞系的倍增時(shí)間;應(yīng)用噻唑藍(lán)(

6、MTT)比色法測(cè)定耐藥細(xì)胞株對(duì)奧沙利鉑的敏感性及耐藥指數(shù);采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot方法測(cè)定耐藥細(xì)胞株與親代細(xì)胞株中的EphA2表達(dá);并采用RNA干擾技術(shù)靶向沉默EphA2在胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)因子上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)水平，MTT法檢測(cè)沉默EphA2對(duì)胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)

7、胞L-OHP敏感性變化。
　　結(jié)果：
　　1.歷時(shí)6個(gè)月建成人胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP。SGC-7901/L-OHP細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)條形與梭形，邊緣伸出長(zhǎng)角，細(xì)胞間連接較松散，獲得了間質(zhì)樣表型;繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為27.44±2.01h，與胃癌SGC-7901細(xì)胞相比，增殖速度減慢，群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)約3h(P＜0.05)。隨濃度增高，L-

8、OHP對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞以及SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，同一濃度L-OHP對(duì)SGC-7901/L-OHP細(xì)胞的抑制率明顯低于胃癌SGC-7901細(xì)胞(P＜0.05)，胃癌奧沙利鉑耐藥SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥指數(shù)為9.7，并且經(jīng)反復(fù)傳代、凍存、復(fù)蘇后，復(fù)測(cè)其耐藥指數(shù)仍保持不變。
　　2.與胃癌SGC-7901細(xì)胞比較，SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中EphA2mRNA和蛋白

9、的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05）。
　　3.EphA2 siRNA能明顯抑制SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中EphA2mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。
　　4.沉默SGC-7901/L-OHP細(xì)胞中EphA2的表達(dá)，能夠顯著上調(diào)E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05），并下調(diào)N-cadherin和SnailmRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，并且增加SGC-7901/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感

10、性(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.利用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立的人胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP，具有穩(wěn)定的耐藥性，可為體外腫瘤細(xì)胞耐藥研究提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　2.人胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株SGC-7901/L-OHP中EphA2呈過(guò)表達(dá)，并且EphA2參與了胃癌細(xì)胞在耐藥形成過(guò)程中EMT的發(fā)生。
　　3.EphA2 siRNA能夠抑制胃癌奧沙利鉑耐藥SGC-7901/L-OHP細(xì)胞