經(jīng)側(cè)腦室單次注射Forskolin對(duì)大鼠海馬tau蛋白磷酸化和空間記憶能力的影響及二者之間的關(guān)系.pdf

1、過(guò)度磷酸化的tau蛋白是阿爾茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)患者腦神經(jīng)元中以雙股螺旋絲(pariedhelicalflaments，PHF)為基本單位的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，NFT)的主要成分，而后者是AD的特征性病理改變之一[1-3]。tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，它能增加微管組裝速度并在生長(zhǎng)端降低微管分子解聚速度，在AD患者腦中過(guò)度磷酸化的tau蛋白已喪失其生物學(xué)功能，從

2、而導(dǎo)致微管解聚、軸突轉(zhuǎn)運(yùn)受損和神經(jīng)元退行性變[4-5]。至今，國(guó)際尚無(wú)公認(rèn)的神經(jīng)元退行性變的動(dòng)物模型。我們最近的研究顯示：在大鼠側(cè)腦室注射一種cAMP-依賴性蛋白激酶A(cAMPdependentproteinkinase，PKA)的特異性激動(dòng)劑Forskolin后，在24h時(shí)引起tau蛋白過(guò)度磷酸化和大鼠空間記憶障礙[6]。為了進(jìn)一步探討：1、在成年大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射不同濃度PKA的特異性激動(dòng)劑Forskolin后，在同一時(shí)間點(diǎn)觀察P

3、KA激活后對(duì)大鼠海馬tau蛋白磷酸化程度和空間記憶的影響及二者之間的關(guān)系；2、結(jié)合第一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳濃度后在成年大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射同一濃度的Forskolin后，在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察其對(duì)大鼠海馬tau蛋白磷酸化和空間記憶保留能力的影響的持續(xù)時(shí)間以及兩種病理改變之間的關(guān)系。經(jīng)側(cè)腦室注射PKA的激動(dòng)劑-Forskolin，用特定抗體通過(guò)免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)大鼠海馬tau蛋白磷酸化水平的改變，同時(shí)用Morris水迷宮法檢測(cè)大

4、鼠空間記憶能力。我們觀察到的結(jié)果如下： 一、不同濃度的Forskolin對(duì)大鼠海馬tau蛋白磷酸化和空間保留記憶能力的影響及兩者之間的關(guān)系 分別將40μl的0μM、20μM、40μM、80μM、120μM、160μM及200μM的Forskolin經(jīng)側(cè)腦室注入大鼠24h后免疫印跡和免疫組化的結(jié)果顯示：1、大鼠海馬的tau蛋白PHF-1位點(diǎn)(Ser-396/404)和PS214位點(diǎn)(Ser-214)的磷酸化程度及Tau-1

5、位點(diǎn)(Ser-198/199/202)的非磷酸化水平降低程度在20μM時(shí)即明顯升高(P＜0.05)，從20μM到80μMForskolin引起的tau蛋白的在這些位點(diǎn)的磷酸化程度依次增強(qiáng)；而從80μM到200μMForskolin引起的tau蛋白的在這些位點(diǎn)的磷酸化程度則依次減弱；其中80μMForskolin引起的tau蛋白的在這些位點(diǎn)的磷酸化程度最強(qiáng)(P＜0.01)，而200μMForskolin對(duì)tau蛋白這些位點(diǎn)的磷酸化的作用不

6、明顯(P＞0.05)。2、80μMForskolin對(duì)蛋白磷酸酯酶2A(ProteinPhosphatase-2A，PP2A)的催化亞基無(wú)明顯的影響(P＞0.05)；200μMForskolin則使PP2A催化亞基的活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：80μMForskolin能明顯的引起大鼠的空間記憶保留能力障礙(P＜0.01)；而200μMForskolin對(duì)其的影響不明顯(P＞0.05)。將大鼠空間記憶保留障礙與海

7、馬tau蛋白磷酸化作相關(guān)性分析結(jié)果顯示：大鼠空間記憶保留障礙與海馬tau蛋白PHF-1位點(diǎn)的磷酸化程度呈正相關(guān)(r=0.998，P＜0.05)；與海馬tau蛋白Tau-1位點(diǎn)的非磷酸化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.997，P＜0.05)；而與海馬tau蛋白PS214位點(diǎn)的磷酸化程度無(wú)相關(guān)性(r=0.91，P＞0.05)。注射不同濃度的Forskolin(0μM、80μM和200μM)后48h，對(duì)大鼠海馬tau蛋白磷酸化和空間保留記憶影響的趨勢(shì)

8、與24h時(shí)一致。 二、單次側(cè)腦室注射同一濃度Forskolin后，大鼠海馬tau蛋白磷酸化和空間保留記憶障礙變化的時(shí)相特點(diǎn)及二者之間的關(guān)系。 根據(jù)第一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇了80μM的Forskolin作為最佳濃度注射。免疫印跡與免疫組化的結(jié)果顯示：tau蛋白在Ser-396/404和Ser-214位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化水平及Ser-198/199/202位點(diǎn)非磷酸化水平降低的程度在24h，48h和72h均有顯著升高(P＜0

9、.05)，在48h時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01)，而在72h時(shí)則呈恢復(fù)趨勢(shì)。水迷宮的結(jié)果顯示：大鼠在注射后24h，48h和72h均有空間記憶障礙(P＜0.05)，且這種記憶障礙在48h最明顯(P＜0.01)，在72h時(shí)亦呈明顯恢復(fù)趨勢(shì)；大鼠海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化和空間保留記憶障礙之間作相關(guān)性分析結(jié)果顯示：大鼠空間記憶保留障礙與海馬tau蛋白PHF-1位點(diǎn)的磷酸化程度呈正相關(guān)(r=0.97，P＜0.05)；與海馬tau蛋白Tau-1位點(diǎn)的非

10、磷酸化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.963，P＜0.05)；而與海馬tau蛋白PS214位點(diǎn)的磷酸化程度無(wú)相關(guān)性(r=0.705，P＞0.05)。 結(jié)論：1、不同濃度的PKA的特異性激動(dòng)劑Forskolin對(duì)大鼠海馬tau蛋白磷酸化和空間記憶保留能力的影響不同，80μMForskolin對(duì)其的作用能力最強(qiáng)，200μMForskolin對(duì)其基本不影響。2、大鼠側(cè)腦室單次注射80μMForskolin只在一定時(shí)間內(nèi)引起大鼠海馬tau蛋白過(guò)