前列腺素E-,2-活化Wnt-β-catenin通路促進肝癌細胞生長的機制研究.pdf

1、目的:環(huán)氧酶-2(COX-2)在肝細胞癌發(fā)病中的作用近年來逐漸被認識,COX-2可能通過促進細胞增殖抑制凋亡,增強癌細胞侵襲轉移能力,促進腫瘤血管生成等多方面的作用參與肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展。目前多認為COX-2的作用是通過前列腺素E2(PGE2)產(chǎn)生的,后者與胞膜EP受體結合后發(fā)揮促腫瘤生長和轉移的作用,但具體的細胞內信號轉導通路尚不清楚。
　　 Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路在調控細胞的生長、運動和分化,以

2、及在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生及侵襲轉移過程中起重要作用,已被確認是與腫瘤相關的一個關鍵性信號通路。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在30％～40％的肝細胞癌細胞中存在β-catenin的高表達和核內聚集,Wnt/β-catenin信號通路在肝癌細胞中被激活。本課題擬研究COX-2和PGE2對人肝細胞癌Hep3B細胞增殖以及細胞內Wnt/β-catenin信號通路的調控作用,試圖闡明COX-2促肝癌生長的分子機制。
　　 方法:一、采用逆轉錄-聚合酶鏈

3、反應(RT-PCR)檢測人肝細胞癌Hep3B細胞和人正常肝細胞系QSG7701細胞內COX-2mRNA和PGE2 EP受體mRNA的表達,CCK-8細胞計數(shù)法檢測PGE2、特異性的EP2受體激動劑布他前列素(butaprost)、EP3/EP4受體激動劑乙醇前列腺素E1(PGE1 alcohol)以及選擇性的COX-2抑制劑尼美舒利對細胞增殖活性的影響,并觀察PGE2對尼美舒利作用的影響,確定藥物作用的量效和時效關系。
　　 二

4、、用陽離子脂質體對Hep3B細胞進行COX-2 siRNA(small interferingRNA)的轉染,RT-PCR檢測COX-2 mRNA表達水平的變化,CCK-8細胞計數(shù)法檢測COX-2基因表達下調后對細胞增殖活性的影響。
　　 三、設計靶向COX-2基因的RNA干擾序列,構建作用于COX-2 mRNA的發(fā)卡狀RNA(COX-2 shRNA)的表達載體,進行Hep3B細胞轉染,并篩選穩(wěn)定表達COX-2 shRNA的細胞

5、。采用RT-PCR檢測COX-2 mRNA表達水平的變化,CCK-8法考察COX-2 shRNA表達質粒轉染Hep3B細胞后對細胞增殖的影響。
　　 四、將用以檢測β-catenin/TCF/LEF轉錄活性的熒光素酶報告質粒TOPflash和FOPflash轉染肝癌Hep3B細胞,使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分別測定PGE2、butaprost、尼美舒利和COX-2shRNA對細胞內熒光素酶轉錄活性的影響,以確定PGE2和COX-2是

6、否影響β-catenin/TCF/LEF的轉錄活性。對Hep3B細胞進行β-catenin siRNA的轉染,檢測β-catenin基因表達下調后對PGE2促細胞增殖作用的影響,闡明Wnt/β-catenin信號通路是否與PGE2的促生長效應相關。
　　 五、采用免疫印跡技術分別檢測PGE2和COX-2shRNA對肝癌Hep3B細胞內β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)的影響,探討PGE2

7、和COX-2對β-catenin的作用。采用免疫印跡技術檢測PGE2刺激Hep3B細胞后,細胞內糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(Ser9)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(Thr308)蛋白水平的變化,并觀察磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)抑制劑沃曼青霉素(wortmannin,WM)預處理Hep3B細胞后再給予PGE2刺激,細胞內Akt、GSK-3

8、β磷酸化水平和β-catenin/TCF/LEF轉錄活性的變化,探討PGE2是否通過PI3K-Akt途徑對GSK-3β磷酸化后激活Wnt/β-catenin信號通路。
　　 結論:PGE2和EP2受體激動劑促進表達COX-2和EP受體的肝細胞癌Hep3B細胞的增殖,而COX-2抑制劑和COX-2基因下調均能抑制Hep3B細胞的增殖,表明COX-2和其催化生成的PGE2具有促進肝細胞癌生長的作用,此作用可能通過細胞膜上的EP2受體

9、介導。PGE2抑制Hep3B細胞內β-catenin蛋白的磷酸化,增加Hep3B細胞內β-catenin蛋白含量,增強β-catenin/TCF/LEF的轉錄活性:EP2受體激動劑butaprost顯著增強β-catenin/TCF/LEF的轉錄活性,作用與PGE2類似；COX-2基因表達下調促進Hep3B細胞內β-catenin蛋白的磷酸化,降低Hep3B細胞內β-catenin蛋白水平,抑制β-catenin/TCF/LEF的轉錄活

10、性；COX-2抑制劑尼美舒利顯著抑制β-catenin/TCF/LEF的轉錄活性,此作用可被PGE2削弱；β-catenin基因下調顯著抑制PGE2的促增殖作用。上述結果表明COX-2和其催化生成的PGE2通過抑制細胞內β-catenin蛋白的磷酸化和降解,增強β-catenin/TCF/LEF的轉錄活性,產(chǎn)生促進Hep3B細胞增殖的作用。PGE2促進Hep3B細胞Akt和GSK-3β的磷酸化,此作用可被PI3K特異性的抑制劑WM所阻斷