腸黏膜屏障在肝硬化代償期向失代償期轉化中作用的實驗研究.pdf

1、肝硬化是一種以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結節(jié)形成為特征的慢性肝病，依據臨床表現可分為代償期和失代償期，代償期階段肝細胞功能尚足以維持機體基本的代謝需要且臨床癥狀多缺乏特異性，因而很少引起患者的重視，待進入失代償期階段，健存肝細胞不能滿足機體基本的生理需要，則出現以肝細胞功能減退和門靜脈高壓為主的臨床表現，但兩期界限常不清。采用目前廣泛使用的Child-Pugh分級方法一般認為，Child-PughA級為肝功能代償期，Child-P

2、ughC級為肝功能失代償期，而Child-pughB級為代償與失代償之間的過渡階段。目前臨床對于肝硬化失代償期的治療仍然限于對癥治療、改善肝功能及并發(fā)癥的治療幾個方面。腸源性內毒素血癥(IETM)學說的提出為我們提供了研究肝病發(fā)生機制新的途徑，我室先前的多項實驗表明，IETM是肝炎慢性化和重型化的重要參與因素，同時IETM在肝性腦病、肝腎綜合征的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。我們設計的如下系列實驗，試圖從肝硬化代償期向失代償期轉化的角度探討

3、腸黏膜屏障功能減退所引起的腸源性內毒素血癥的作用，以提示臨床工作者注重腸道功能的維護將有助于肝硬化患者預后的改善。 本研究分三部分。第一部分肝硬化大鼠腸道通透性變化與腸源性內毒素血癥之間關系的研究，共含4個實驗。實驗一采用我室創(chuàng)建的復合因素肝硬化模型，研究大鼠肝硬化時肝功能分級與腸源性內毒素之間的關系。結果表明肝硬化6周及10周大鼠肝功能Child分級與門靜脈內毒素血癥呈顯著正相關關系(r=0.680，P＜0.01)。實驗二用不

4、同分子量的探針(異硫氰熒光素標記的葡聚糖，FITC-D和Ⅱ型辣根過氧化酶，HRP-Ⅱ)灌胃后直接測定它們在門靜脈血中的含量來研究肝硬化大鼠腸黏膜通透性，并與門靜脈內毒素水平進行相關性分析。結果表明不同階段肝硬化大鼠Child-Pugh分級與門靜脈內毒素、FITC-D及HRP-Ⅱ之間用Kendall'stau-b方法比較均呈正相關關系，r值分別為0.746、0.599和0.630，P值均小于0.01。提示門靜脈內毒素血癥的形成是由于腸黏膜

5、通透性升高引起的。實驗三通過研究肝硬化時肝臟kupffer細胞吞噬清除印度墨汁的情況及免疫組化對kupffer細胞溶菌酶染色情況，探討肝臟kupffer細胞在肝硬化體循環(huán)內毒素血癥形成中的作用。結果表明注射印度墨汁24小時后，肝硬化動物肝組織中含墨汁顆粒的細胞較正常為多，顆粒也較正常大，且多靠近纖維間隔附近，說明肝硬化時kupffer細胞對墨汁吞噬清除能力的減退，但對kupffer細胞溶菌酶染色發(fā)現kupffer細胞總的數量隨著肝硬化程

6、度的加重而增加。這就提示肝硬化時kupffer細胞吞噬功能減退更可能是由于肝硬化肝組織結構改建的結果，此時肝臟kupffer細胞的分泌功能不受明顯影響，這一點更有利于IETM的形成，同時受體循環(huán)內毒素的影響，肝臟kupffer細胞可分泌大量的TNF-α，進而引起細胞因子級聯反應，造成多器官功能的損害。實驗四通過直接進行回腸末端腸內容物涂片革蘭氏染色，分析球/桿比值和G+/G-比值，借此判斷回腸末端細菌增殖和菌群失調情況。結果表明，肝硬化

7、大鼠回腸末端存在細菌增殖和菌群失調，且以G-桿菌數量增加為甚，提示在腸黏膜通透性增加的情況下形成細菌移位的可能。 第二部分通過研究肝硬化大鼠肝、腸組織TNF-α及其mRNA表達情況，結合腸組織細胞凋亡、勻漿髓過氧化物酶(MPO)和組胺水平，探討肝硬化大鼠腸黏膜通透性增高的機制。包括2個實驗。實驗一用TUNEL方法觀察6周及10周肝硬化大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡情況。結果表明，肝硬化大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡數量隨肝硬化進程的發(fā)展而增加，

8、并與門靜脈內毒素水平呈正相關關系。實驗二觀察肝硬化動物及肝硬化基礎上尾靜脈注射GdCl3后肝、腸組織TNF-α及其mRNA表達情況，以及腸組織MPO、組胺的變化情況。結果表明肝硬化大鼠肝、腸組織中TNF-α及其mRNA表達均較正常對照高，但用GdCl3阻斷kupffer細胞后，肝、腸組織中TNF-α及其mRNA表達沒有顯著改變，同時腸組織中MPO、組胺反而升高，腸組織中肥大細胞數量較未注射GdCl3組增多，提示肝外單核巨噬系統(tǒng)的激活在肝

9、硬化動物腸黏膜通透性的變化中發(fā)揮著重要作用。 第三部分為干預性研究。因所用模型飲食中鈉鹽含量偏低，故觀察在正常NaCl攝入以及用甘氨酸2周的情況下，腸黏膜通透性變化情況。結果表明，補充生理需要量的NaCl后腹水發(fā)生率未見增高，且門靜脈內毒素水平出現下降，與模型組比較有顯著性差異，因此我們推測生理需要量的NaCl可能具有保護腸黏膜屏障的作用。給肝硬化大鼠甘氨酸5g/kg.d灌胃后，其門靜脈內毒素水平和探針水平均顯著降低，已接近對照

10、組大鼠，但肝組織學改變并不明顯，提示甘氨酸改善肝功能的作用主要是通過保護腸黏膜屏障功能而實現的。 通過上述實驗，得出以下結論：1、實驗研究表明，肝硬化Child-Pugh分級與門靜脈內毒素水平呈正相關關系，隨著肝硬化的加重，腸黏膜通透性也逐漸增高，同時由于回腸末端發(fā)生細菌增殖與菌群失調而且G-細菌占主導地位，也進一步加強門靜脈內毒素血癥的形成。 2、腸黏膜通透性的增高和腸道菌群易位所引起的腸源性內毒素血癥是肝硬化失代償期