鼠疫F1抗原的磁粉球-ELISA和免疫-PCR檢測技術(shù)的建立.pdf

1、鼠疫(plague)是鼠疫耶爾森氏菌引起的以跳蚤為媒介的在溫血動物尤其是嚙齒類動物間流行的自然疫源性疾病，同時也是危害嚴重的人獸共患病。在世界范圍內(nèi)均有其疫源地分布。歷史上曾3次出現(xiàn)鼠疫大流行，死亡人數(shù)數(shù)以千萬計。目前其流行呈現(xiàn)以下特點：流行范圍有所擴大，疫情有上升趨勢；某些疫區(qū)間隔多年后又出現(xiàn)小面積暴發(fā)；疫區(qū)有向城市和人口密集區(qū)蔓延的趨勢；主要宿主數(shù)量明顯回升，某些地區(qū)動物鼠疫重新發(fā)生。在我國，1978～1997年共有云南、西藏、青海

2、、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古六省發(fā)生人間鼠疫456例，死亡105例，病死率達23.03％；其中1978～1987年發(fā)生106例，1988～1997年發(fā)生350例，后10年是前10年的3.3倍，呈明顯上升趨勢；發(fā)病地區(qū)主要是旱獺疫源地和黃胸鼠疫源地?！笆濉逼陂g，共有7省(區(qū))43縣發(fā)生人間鼠疫206例，14省(區(qū))278縣次發(fā)生動物鼠疫疫情，其中13個為新增鼠疫疫源縣。因此對鼠疫快速準確的診斷顯得尤為重要。傳統(tǒng)的顯微鏡觀察、培養(yǎng)、噬菌體裂解和動

3、物實驗4步檢測法，耗時較長，步驟繁瑣，不能滿足現(xiàn)場流行病學調(diào)查需要。隨著免疫學等技術(shù)的發(fā)展，針對鼠疫各種特異性抗原、毒力因子及其抗體的新的診斷方法不斷涌現(xiàn)，如間接血凝法(Indirect hemagglutination assay,IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme LinkedImmunosorbcnt Assay,ELISA)、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(DOT-ELISA)、放射免疫沉淀法(Radioimmuno Precipi

4、tation Test，RIP)等。許多蛋白和因子被選為這些診斷方法的標靶，如pgm、pst、Yops、F1抗原、V抗原等。其中F1抗原是鼠疫菌的特異性抗原，也是被證實的保護性抗原。鼠疫菌F1抗原是存在于鼠疫菌體表面的莢膜物質(zhì)，由分子量為61-65MD的質(zhì)粒編碼，在37℃培養(yǎng)時可以產(chǎn)生。實驗表明，從大腸桿菌重組株中純化的F1抗原能保護小鼠對抗經(jīng)皮下或吸入途徑的強毒菌的攻擊，因此針對F1抗原或抗體的檢測成為鼠疫診斷方法研究的熱點。

5、 趙旭東等根據(jù)某些高分子化學物質(zhì)的聚合性質(zhì)，結(jié)合免疫親和層析和磁學原理研制出磁粉球。通過使用抗原(或抗體)對磁粉球致敏，即可應(yīng)用于其對應(yīng)的抗體(或抗原)的篩選和純化，從而實現(xiàn)液體介質(zhì)中某些抗原或抗體的富集，提高檢測的陽性率。國外一些文獻報道應(yīng)用磁性吸附顆?？梢詫崿F(xiàn)對某些蛋白、細胞因子甚至核酸的分離和純化。目前，國內(nèi)也有個別學者嘗試應(yīng)用國外磁珠產(chǎn)品分離、檢驗?zāi)[瘤細胞，但磁粉球的自主生產(chǎn)及應(yīng)用于純化和檢測抗原(或抗體)的研究國內(nèi)尚未見報道。

6、 免疫-PCR(immuno polymerase chain reaction，I-PCR)是1992年Sano T等建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是將一段生物素標記的已知序列的DNA分子特異性的連接到抗原一單克隆抗體復合物上，PCR擴增該DNA片段，通過電泳定性分析，根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無來判斷待測抗原是否存在。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機結(jié)合起來，其本質(zhì)是一種以PCR擴增一段

7、DNA報告分子代替酶反應(yīng)來放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。由于該方法同時具備免疫學抗原抗體反應(yīng)的高特異性和分子生物學PCR技術(shù)的強大擴增能力，必將在疾病的診斷，特別是極微量抗原檢測中發(fā)揮巨大的作用。目前，將免疫-PCR應(yīng)用于鼠疫檢測的研究尚未見報道。 本研究擬通過制備磁粉球及抗鼠疫F1單克隆抗體(McAb)，創(chuàng)建針對鼠疫F1抗原的磁粉球-ELISA和免疫-PCR檢測方法；并通過對鼠疫F1抗原檢測，就其敏感性、穩(wěn)定性、實

8、用性和操作的簡便情況與夾心-ELISA、生物素-ELISA(ABC-ELISA)進行綜合比較，以確定這兩種檢測方法在臨床和流行病學調(diào)查中應(yīng)用的可行性，以期找到一種簡潔、高效、準確率高的血清學診斷方法，并對其應(yīng)用前景進行初步評價。 方法: 采用聚合法研制磁粉球，將磁粉、苯乙烯、甲苯、反丁烯二酸、對二甲苯攪拌混勻后，置分散液中，在催化劑作用下，于80～90℃溫度下高速攪拌、洗滌、分離，于-20℃、-5℃和4℃存放條件下觀察磁

9、粉球放置1～6個月的理化穩(wěn)定性。 將鼠疫F1抗原加入含碳二亞胺的磁粉球PBS混合液，4℃放置48h形成致敏磁粉球。將待提純鼠疫抗體加入致敏磁粉球中，37℃搖床振搖1h，洗滌，pH2.5～2.8甘氨酸鹽酸解離透析。 常規(guī)方法制備抗鼠疫F1抗原特異McAb，應(yīng)用磁粉球進行純化，間接ELISA法檢測其抗體滴度，布魯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O<,3>、O<,9>、傷寒桿菌、霍亂弧菌、痢疾桿菌、出血大腸桿菌、致病大腸桿菌抗原作包

10、被抗原檢測其特異性。采用棋盤滴定法，確定最佳多抗包被濃度、單抗和親合素稀釋濃度，應(yīng)用常規(guī)夾心ELISA和ABC-ELISA法，檢測不同濃度的鼠疫F1抗原。 磁粉球-ELISA檢測方法為：將抗鼠疫F1抗原McAb致敏的磁粉球加入含鼠疫F1抗原待測樣本的Ep管內(nèi)，37℃輕度渦式搖動40min，以后各步驟與常規(guī)ELISA基本相同，不同點為各步驟均要輕度渦式搖動，且需應(yīng)用磁鐵吸附磁粉球結(jié)合PBS-T<,20>進行洗滌。將其敏感度、穩(wěn)定性

11、與上述3種實驗方法進行對比。 以生物素標記M13-20(Bio-5’-GTAAAACGGCCAGT-3’)為上游引物，無生物素標記M13(5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’)為下游引物，構(gòu)建生物素標記DNA探針，目的片段長度為227bp，I-PCR法檢測鼠疫菌不同濃度的F1抗原。 結(jié)果: 研制出的磁粉球是直徑為0.5～2.0μm的球狀體，比重1.07～1.15， -5℃和4℃條件下存放6個月，加入

12、硫酸后質(zhì)量分別減少10％和6％； 經(jīng)F1抗原致敏后純化抗鼠疫F1 McAb的量最高達1.9mg/g；F1抗原致敏的磁粉球-5℃和4℃存放6個月后，純化抗體量分別減少5.3％和26％； 制備的抗鼠疫F1 McAb，為IgG1亞型，滴度為1：1×10<'6>，與布魯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O3、O9等無交叉反應(yīng)； 夾心-ELISA的最適多抗稀釋比例為1：1000，單抗稀釋比例為1：2000，可檢測到的最低鼠疫F1抗

13、原濃度為0.032μg/ml，平行對照OD值差異<0.034，重復3次，檢測到的最低抗原濃度不變； ABC-ELISA的最適親合素濃度為1μg/ml，可檢測到的最低鼠疫抗原濃度為0.004μg/ml，平行對照OD值差異<0.063，重復3次，檢測到的最低抗原濃度不變； 磁粉球．ELISA檢測到的最低抗原濃度為0.002μg/ml，平行對照OD值差異<0.031，重復3次，檢測到的最低抗原濃度不變； I-PCR的最

14、適親合素濃度和生物素標記DNA探針濃度為10ng/ml和10pg/ml，可檢測到最低鼠疫F1抗原濃度可達5pg/ml，5次重復實驗，2次有假陽性條帶出現(xiàn)； 結(jié)論:本實驗研制的磁粉球在抗原、抗體的純化和疾病的免疫學診斷方面，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景；所制備的抗鼠疫F1抗原McAb通過致敏磁粉球純化后，純度高、特異性強； 所建立的磁粉球-ELISA法檢測樣本量大、穩(wěn)定性好、靈敏度高，與夾心．ELISA和ABC-ELISA相比，