腦內(nèi)Oatp2與AEDs的相關(guān)性及其影響因素的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠體內(nèi)0atp2表達狀況及其年齡特征 目的：探討Oatp2在正常大鼠腦、肝組織內(nèi)的表達及年齡因素對其表達的影響。 方法：健康成年，生后20天，生后3天的Wistar大鼠各12只，雌雄各半。取腦、肝組織，免疫組化檢測Oatp2蛋白的分布及表達，RT-PCR檢測Oatp2-mRNA表達，比較年齡因素對Oatp2表達的影響。 結(jié)果：(1)正常大鼠腦內(nèi)Oatp2主要分布于腦微血管內(nèi)皮細胞、脈絡(luò)叢上皮細胞及小腦神

2、經(jīng)元；(2)正常大鼠肝內(nèi)Oatp2主要表達于肝細胞，以門靜脈周圍最為顯著；(3)腦內(nèi)Oatp2表達呈現(xiàn)隨年齡增加表達下降趨勢，而肝內(nèi)Oatp2表達則隨年齡增加而增加。 結(jié)論：(1)正常大鼠腦、肝內(nèi)均存在Oatp2表達，提示Oatp2在相應(yīng)底物的體內(nèi)過程中具有重要作用；(2)年齡是影響大鼠腦、肝內(nèi)Oatp2表達的因素。 第二部分癇性發(fā)作和AEDs對腦內(nèi)Oatp2表達的影響 目的：研究癇性發(fā)作及AEDs對大鼠腦內(nèi)Oa

3、tp2表達的影響。 方法：健康成年Wistar大鼠，經(jīng)腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)60min持續(xù)’驚厥發(fā)作(60’SC)，(1)在60’SC后6h-8w的6個不同時點上，采用免疫組化法檢測Oatp2在腦、肝內(nèi)的分布，Western blot和RT-PCR檢測Oatp2蛋白及mRNA的表達水平，研究各時點Oatp2表達的動態(tài)變化；(2)選取60’SC后4w大鼠，分別予VPA(187.5mg/kg)、CBZ(125mg/kg)、PH

4、T(62.5mg/kg)治療4周后，采用免疫組化法檢測大鼠腦、肝組織內(nèi)Oatp2、P-gp的分布，western-blot及RT-PCR方法分別檢測Oatp2、P-gp蛋白質(zhì)及mRNA的表達水平。 結(jié)果：(1)腦內(nèi)P-gp主要分布于腦血管內(nèi)皮細胞及脈絡(luò)叢上皮細胞；(2)60’SC后各時點及AEDs治療各組大鼠腦內(nèi)Oatp2、P-gp仍主要表達于腦血管內(nèi)皮細胞及脈絡(luò)叢上皮細胞；(3)在60’SC后各時點的腦內(nèi)Oatp2蛋白表達隨時

5、間延長而有下降趨勢，以60’SC后8w最為顯著(P<0.01)；(4)慢性癲癇(60’SC后4w、8w)大鼠腦內(nèi)存在Oatp2表達下降及P-gp表達增加，且變化程度與SRSs次數(shù)呈正相關(guān)；(5)各治療組腦內(nèi)Oatp2蛋白表達較正常對照組明顯下降(P<0.05)，而P-gp表達則較正常對照明顯增加(P<0.05)；(6)各組腦內(nèi)P-gp蛋白表達與mRNA表達具有較好的一致性，而腦內(nèi)Oatp2-mRNA表達無相應(yīng)蛋白表達變化趨勢。

6、結(jié)論：(1)癇性發(fā)作和AEDs(VPA、CBZ、PHT)均可抑制腦內(nèi)Oatp2表達，并誘導(dǎo)腦內(nèi)P-gp表達增加，提示Oatp2在癲癇病理過程中可能存在與P-gp不同的作用；(2)腦內(nèi)Oatp2蛋白的表達可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因素，癇性發(fā)作和AEDs可能均是影響其基因表達及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的因子。 第三部分 Oatp2與AEDs關(guān)系的體外研究 目的：以體外培養(yǎng)的BMECs作為BBB的體外模型，研究Oatp2對丙戊酸鈉的轉(zhuǎn)運作用，及丙

7、戊酸鈉等抗癲癇藥對BMECs上Oatp2表達的影響 方法：(1)貼塊法培養(yǎng)并鑒定腦微血管內(nèi)皮細胞，免疫細胞化學(xué)、Western blot法和RT-PCR法檢測Oatp2及P-gp在BMECs上的表達；(2)研究10μg/ml～200μg/ml五個不同VPA濃度及2min～60min五個不同孵育時間對BMECs吸收VPA的影響；(3)研究Oatp2<'+>/Oatp2<'->細胞(BMECs/成纖維細胞)對VPA的吸收；(4)研究

8、Oatp2抑制劑(高濃度地高辛)對VPA吸收的影響；(5)給予不同濃度的VPA、PHT、CBZ持續(xù)作用于培養(yǎng)的BMECs，分別在給藥后1w及4w用Western blot法檢測細胞上Oatp2、P-gp蛋白表達情況。 結(jié)果：(1)貼塊法獲得的BMECs呈多角形或鋪路石形，單層貼壁生長。培養(yǎng)細胞Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)、CD<,34>免疫熒光染色均為陽性，細胞純度90％，且有Oatp2及P-gp表達；(2)BMECs對VPA的吸

9、收具有時間依賴和濃度依賴的特點；(3)Oatp2<'+>細胞(BMECs)對VPA的吸收較Oatp2<'->細胞(成纖維細胞)明顯為高(P<0.01)；(4)Oatp2抑制劑可顯著抑制：BMECs對VPA的吸收；(5)三種AEDs均可誘導(dǎo)BMECs上Oatp2表達減少，P-gp表達增加，其影響效應(yīng)與劑量有關(guān)。 結(jié)論：(1)貼塊法可獲得原代培養(yǎng)BMECs，方法簡便易行，細胞純度較高，且有轉(zhuǎn)運體Oatp2及P-gp的表達，可作為血腦