RNAi致DKK-1基因沉默的骨髓瘤細(xì)胞株對鼠胚胎成骨細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：(1)建立RNAi后DKK-1基因長期沉默的人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞RPMI8226細(xì)胞株；(2)研究RPMI8226細(xì)胞通過RNAi導(dǎo)致DKK-1基因沉默，DKK-1表達(dá)下降，減輕對小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的抑制，初步探討DKK-1在MM骨損發(fā)病中的作用。 方法：(1)設(shè)計(jì)1對DKK-1miRNA前體DNA寡核苷酸引物，退火成雙鏈后克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR質(zhì)粒，再通

2、過GatewayR技術(shù)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，得到重組質(zhì)粒pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR，與慢病毒包裝質(zhì)粒一起經(jīng)lipofectamineTMM2000轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48h后收獲細(xì)胞上清液獲得慢病毒，高速離心濃縮后感染RPMI8226細(xì)胞株，10μg/mlBlasticidin篩選12天得到DKK-1基因長期沉默的RPMI8226細(xì)胞株，RT-PCR檢測胞漿DKK-1mRNA表達(dá)和Western-blotting檢測濃縮50

3、倍的細(xì)胞上清液中DKK-1蛋白的表達(dá)來分析DKK-1RNAi效率：(2)將RPMI8226原細(xì)胞株、DKK-1RNAi的RPMI8226細(xì)胞株和無關(guān)序列RNAi的RPMI8226細(xì)胞株等3種細(xì)胞培養(yǎng)上清液以20％體積比的量分別加入BMP-2誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞培養(yǎng)體系中，10天后觀察3者對MC3T3-E1細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的抑制效率，觀察指標(biāo)為MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)mRNA及活性的變化。 結(jié)果：(1

4、)293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染18小時(shí)后在熒光顯微鏡下整個(gè)培養(yǎng)板顯現(xiàn)滿視野綠色熒光，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率90％左右；(2)慢病毒高速離心濃縮15倍后感染NIH3T3細(xì)胞，48h表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EmGFP)，流式細(xì)胞術(shù)檢測NIH3T3細(xì)胞EmGFP表達(dá)率計(jì)算出慢病毒濃縮液滴度為3.89×105TU/ml；(3)分別用0、2、4、6、8、10μg/mlBlasticidin處理RPMI8226細(xì)胞12天，僅10μg/ml組沒有存活細(xì)胞存在；(4)

5、在8μg/mlPolybreneR作用下，0.5ml慢病毒濃縮液感染2×104個(gè)RPMI8226細(xì)胞，10μg/mlBlasticidin篩選12天后得到約2000個(gè)表達(dá)DKK-1shRNA的RPMI8226細(xì)胞克隆，細(xì)胞擴(kuò)增后RT-PCR結(jié)果顯示DKK-1mRNA表達(dá)降低了86％，Western-blotting結(jié)果顯示DKK-1蛋白表達(dá)降低了88％；(5)MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)50ng/mlBMP-2誘導(dǎo)10天后胞漿ALPmRNA表

6、達(dá)增強(qiáng)6.9倍，ALP活性增強(qiáng)7.1倍；(6)跟單BMP-2誘導(dǎo)組相比，加入20％體積比的RPMI8226細(xì)胞培養(yǎng)上清液能強(qiáng)烈抑制MC3T3-E1細(xì)胞分化，培養(yǎng)10天后MC3T3-E1細(xì)胞ALPmRNA表達(dá)僅增強(qiáng)了2.2倍，ALP活性增強(qiáng)2.4倍。20％體積比的含DKK-1shRNA的RPMI8226細(xì)胞培養(yǎng)上清液抑制MC3T3-E1細(xì)胞分化能力減弱，10天后MC3T3-E1細(xì)胞ALPmRNA表達(dá)增強(qiáng)5.2倍，ALP活性增強(qiáng)5.5倍，分

7、別跟單BMP-2誘導(dǎo)組和RPMI8226細(xì)胞組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。20％體積比的無關(guān)序列RNAi的RPMI8226細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)10天后MC3T3-E1細(xì)胞ALPmRNA表達(dá)增強(qiáng)2，3倍，ALP活性增強(qiáng)2.6倍。 結(jié)論：(1)基于慢病毒載體的RNAi有較高的基因抑制效率，但缺點(diǎn)是產(chǎn)生慢病毒滴度低，需濃縮后才能感染靶細(xì)胞；(2)MM細(xì)胞通過分泌DKK-1抑制胚胎成骨細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，導(dǎo)致MM體內(nèi)成骨細(xì)胞活