骨髓瘤細(xì)胞DKK-1的表達(dá)及抑制成骨祖細(xì)胞早期分化的探討.pdf

1、[目的]：通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)多發(fā)性骨髓瘤患者血清DKK-1表達(dá)增高，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226表達(dá)DKK-1，進(jìn)一步探討多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226上清液能夠抑制rBMP2誘導(dǎo)的成骨祖細(xì)胞MC3T3E1早期分化過(guò)程，并且以DKK-1單克隆抗體逆轉(zhuǎn)多發(fā)性骨髓瘤分泌DKK-1導(dǎo)致的成骨抑制的狀態(tài)。 [方法]： 1.采用western-blot方法測(cè)定多發(fā)性骨髓瘤患者與正常人血清DKK-1水平。 2.RT-PCR

2、方法測(cè)定多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226在mRNA水平上是否表達(dá)DKK-1，采用western-blot方法檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226上清液中是否存在可溶性的DKK-1。 3.此后將多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226上清加到成骨祖細(xì)胞MC3T3E1含有的50ng/mL人重組骨形成蛋白2(rhBMP2)的誘導(dǎo)分化體系中培養(yǎng)1、3、5天后測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8，培養(yǎng)5天后進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)、堿性磷酸酶

3、(ALP)吸光度測(cè)定。 4.最后將0.1ng/mLDKK-1單抗、1ng/mLDKK-1單抗和10ng/mLDKK-1單抗再分別加入到30％骨髓瘤上清抑制成骨祖細(xì)胞誘導(dǎo)的體系中共同培養(yǎng)5天后測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)、堿性磷酸酶(ALP)染色結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)、堿性磷酸酶(ALP)吸光度測(cè)定以及RT-PCR方法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)和核心結(jié)合因子1(Cbfa-1)的mRNA水平。 [結(jié)果]： 1.采用Westernblo

4、tting法在正常志愿者和多發(fā)性骨髓瘤患者血清中在40KD處測(cè)到DKK-1蛋白，而且多發(fā)性骨髓瘤患者較正常人血清的的DKK-1光密度值有顯著意義增高(P＜0.01)。 2.采用半定量RT-PCR和Westernblotting法證明RPMI8226細(xì)胞株能表達(dá)DKK-1，并且在骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226上清液中以Westernblotting法檢測(cè)到可溶性DKK-1。 3.BMP2能夠誘導(dǎo)成骨祖細(xì)胞MC3T3E1向成骨

5、細(xì)胞分化，ALP染色發(fā)現(xiàn)許多紫紅色結(jié)節(jié)，呈陽(yáng)性反應(yīng)。與空白對(duì)照組相比，ALP吸光度顯著升高，RT-PCR方法檢測(cè)ALP、OC和Cbfa-1mRNA顯著升高(p＜0.01)。 4.采用CASY計(jì)數(shù)方法和CCK-8法，證實(shí)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226上清液能夠抑制成骨祖細(xì)胞MC3T3E1的增殖，30％的上清液的抑制作用比10％及20％上清液顯著，并且這種抑制作用隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。 5.以10％、20％和30％骨髓

6、瘤上清液分別作用于BMP2致成骨祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系5天，30％骨髓瘤上清液ALP染色結(jié)節(jié)和ALP吸光度較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。20％骨髓瘤上清液ALP染色結(jié)節(jié)減少(p＜0.05)而ALP吸光度發(fā)生了顯著意義的減少(P＜0.01)。 6.高濃度的10ng/mLDKK-1單抗加入到30％上清干預(yù)成骨誘導(dǎo)作用5天后，細(xì)胞計(jì)數(shù)未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高。而ALP染色結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)(P＜0.01)和ALP吸光度測(cè)定(P＜0.01)以及

7、ALP(P＜0.05)和cbfa-1(P＜0.01)的mRNA都有顯著意義的升高，中濃度的1ng/mLDKK-1單抗作用后，ALP吸光度測(cè)定和Cbfa-1的mRNA有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義升高(P＜0.05)。 [結(jié)論]： 1.多發(fā)性骨髓瘤患者血清中DKK-1相比正常人顯著升高。 2.多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226在mRNA和蛋白水平上均表達(dá)DKK-1，DKK-1存在于細(xì)胞培養(yǎng)液上清之中。 3.30％多發(fā)性骨髓瘤