沉默TRPV6基因?qū)﹄u成骨細胞增殖、分化及凋亡的影響.pdf

1、成骨細胞是蛋雞髓質(zhì)骨形成的主要功能細胞，其功能受鈣離子的調(diào)節(jié)。Transient receptor potential vanilloid6(TRPV6)是鈣離子跨細胞轉(zhuǎn)運的限速“門控”通道。目前有關(guān)TRPV6對成骨細胞影響的報道主要集中在鼠及人類方面，對禽類國內(nèi)、外很少報道。因此，本試驗通過將沉默TRPV6基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞成骨細胞，檢測TRPV6對成骨細胞增殖、分化及凋亡的影響，旨在為探索蛋雞髓質(zhì)骨形成提供理論基礎(chǔ)。
　　兩次

2、酶消化法培養(yǎng)雞成骨細胞，并用堿性磷酸酶染色及鈣化結(jié)節(jié)染色法鑒定培養(yǎng)的細胞。取16日齡雞胚顱骨，0.1％胰酶消化15min后，剪碎，再用0.1％Ⅱ型膠原酶消化1h，獲取雞胚額骨成骨細胞群并鑒定。采用NBT/BCIP堿性磷酸酶染色試劑盒法對堿性磷酸酶進行染色，茜素紅法鑒定鈣化結(jié)節(jié)。選取生長狀態(tài)良好的成骨細胞，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，同時將成骨細胞分為3個試驗組，分別為用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染沉默TRPV6基因質(zhì)粒組(TRPV6-shRNA質(zhì)粒，

3、轉(zhuǎn)染試劑，成骨細胞)、轉(zhuǎn)染未沉默TRPV6基因質(zhì)粒組(negative-shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑，成骨細胞)及未轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染試劑，成骨細胞），每組8個重復(fù)。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后，分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h。在每一個時間點，用MTT法檢測細胞增殖率，PNPP偶氮法檢測堿性磷酸酶(ALP)活性。選取生長狀態(tài)良好的成骨細胞，接種于6孔板，細胞分組同MTT法，培養(yǎng)48 h時，分別通過熒光定量PCR、Western

4、 blot技術(shù)檢測雞成骨細胞TRPV6、ALP及凋亡相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達。培養(yǎng)72h時用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　結(jié)果表明，經(jīng)酶消化法培養(yǎng)的細胞具有明顯的成骨細胞樣特點，相差倒置顯微鏡觀察可見細胞貼壁生長，呈三角形、星形，80％～90％的細胞堿性磷酸酶染色呈陽性。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞重疊生長，連續(xù)培養(yǎng)13 d后出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅法染色呈強陽性，顯示細胞間出現(xiàn)致密、圓形紅色結(jié)節(jié)。因此，兩次酶消化法可獲得純度較高的

5、成骨細胞，可用于后續(xù)試驗研究。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組能在mRNA和蛋白水平上顯著抑制TRPV6表達(P＜0.05)，表明TRPV6-shRNA質(zhì)粒沉默效果顯著。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的細胞數(shù)量與其他組相比顯著降低(P＜0.05)，24 h時，轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，差異極顯著(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的ALP活性與其他組相比24 h時極顯著降低(P＜0.01)，但48

6、h時為顯著(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的ALP mRNA和蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)。提示，沉默TRPV6后成骨細胞的增殖和分化能力均受到抑制。然而，轉(zhuǎn)染TRPV6-shRNA質(zhì)粒組的細胞凋亡率則顯著升高(P＜0.05)，與未轉(zhuǎn)染組比較差異極顯著(P＜0.01);細胞凋亡相關(guān)基因(Caspases-3，Caspases-7 and Caspases-9)的mRNA表達量均呈升高趨勢，尤其Caspases-3