牛血漿纖維粘連蛋白對大鼠成骨細胞增殖分化及凋亡的影響.pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文牛血漿纖維粘連蛋白對大鼠成骨細胞增殖分化及凋亡的影響姓名：薛明申請學位級別：博士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學指導教師：艾紅軍20040301本實驗應用外源性FIN作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞，旨在研究FN對成骨細胞增殖分化及凋亡的影響，探討應用FN治療骨缺損性疾病的可行性。實驗方法1成骨細胞的分離純化取生后2d的Wistar乳鼠拉頸處死后投入盛有75％乙醇的容器中消毒，剪開頭頂部皮膚，取顱蓋骨放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，用緩沖液

2、洗凈，加入025％胰蛋白酶溶液，在37％恒溫消化15min。再用lm∥nllⅡ型膠原酶溶液在37℃條件下消化90min，移于離心管中離心(1000r／min，5min)用199培養(yǎng)液將沉淀物洗兩次，吹散細胞沉淀，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)。差速黏附法純化細胞。2成骨細胞的培養(yǎng)及鑒定調(diào)整上述已純化的細胞懸液細胞密度至106h／n11，接種于25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5％CO：培養(yǎng)箱中，2d后換液，除去未貼壁細胞，并適時傳代，另在一小

3、培養(yǎng)皿中加入蓋玻片，接種少量細胞懸液，置于37℃、5％CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用I型膠原免疫組化方法作細胞鑒定。3成骨細胞的形態(tài)學觀察應用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察成骨細胞的生長特性并拍照記錄。將培養(yǎng)的成骨細胞用胰酶消化，離心，PBS沖洗，03％的戊二醛和四氧化鋨雙重固定，乙醇逐級脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點干燥，噴金鍍膜，S一520型掃描電鏡觀察；培養(yǎng)形成單層細胞，經(jīng)膠原酶消化，分散離心獲得成骨細胞團塊，加入4％戊二醛預固定，鋨酸染色，His

4、tachi一600型透射電鏡下觀察并拍照紀錄。4AlamarBluelM法測定細胞增殖率取培養(yǎng)的成骨細胞第3代，調(diào)整細胞濃度至2x104／ml，以每孔100出接種于96孔板，每組8孔，培養(yǎng)條件為37。C，5％CO：飽和濕度。在含10％胎牛血清的199液中培養(yǎng)48h，換成濃度為10pg／IIll，20彬IIll，30彬111l，401Lg／ml，50彬111l的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h，在最后4h每孔加入20山的AlamarBlueT