多發(fā)性骨髓瘤患者成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及調(diào)控.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)和純化多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者骨髓來(lái)源成骨細(xì)胞,并鑒定其生物學(xué)性狀,比較其與正常成人骨髓來(lái)源成骨細(xì)胞的增殖分化和成骨潛能。比較治療MM的新型藥物-蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)及MM患者血清對(duì)成骨細(xì)胞成骨能力的影響,初步探討硼替佐米對(duì)MM成骨細(xì)胞的作用及機(jī)制。
　　 方法:研究對(duì)象為MM患者15例,正常對(duì)照10名。采用骨髓培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)和純化MM患者成骨細(xì)胞,傳代后觀察細(xì)胞形態(tài),測(cè)定

2、其生長(zhǎng)曲線、倍增時(shí)間,進(jìn)行堿性磷酸酶染色(ALP)、Von Kossa鈣結(jié)節(jié)染色、Ⅰ型膠原抗體免疫組化染色等鑒定其生物學(xué)性狀,并比較其與正常成人骨髓來(lái)源成骨細(xì)胞的成骨潛能。在骨髓瘤患者成骨細(xì)胞組及正常組中分別加入硼替佐米及骨髓瘤患者血清,對(duì)比加入調(diào)控因子前后細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。使用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)骨髓瘤成骨細(xì)胞細(xì)胞膜抗體(CD34、CD138、CD45)的表達(dá),采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-7(IL

3、-7)的水平,并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞中骨形成蛋白2(BMP2)表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用骨髓培養(yǎng)法,條件培養(yǎng)基中加入地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C等條件因子,在MM患者骨髓中,可培養(yǎng)并純化出成骨細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)多為梭形、多角形,倍增時(shí)間約為38h。ALP染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色及VonKossa鈣染色陽(yáng)性,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。比較傳代培養(yǎng)第6天時(shí)細(xì)胞數(shù),MM患者

4、成骨細(xì)胞數(shù)目(5.77±1.91)較正常對(duì)照組(7.55±2.54)減少(p<0.05)。培養(yǎng)4周后行Von-Kossa's染色,骨髓瘤患者和正常對(duì)照組的成骨細(xì)胞均可見(jiàn)礦化物沉積,但是骨髓瘤患者(6.12±1.63)明顯少于正常對(duì)照組(15.83±2.23)(p<0.05)。
　　 2.正常對(duì)照組加入MM血清共培養(yǎng)后,比較培養(yǎng)傳代第6天時(shí)成骨細(xì)胞增殖數(shù)目(7.38±1.13)較正常培養(yǎng)組(8.25±2.59)減少(p<0.05)

5、,硼替佐米對(duì)正常人的成骨細(xì)胞沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用(p>0.05)。在MM組中比較培養(yǎng)傳代并加入硼替佐米后第6天時(shí)細(xì)胞數(shù),MM患者硼替佐米組成骨細(xì)胞數(shù)目(8.94±2.09)較正常培養(yǎng)組(6.33±1.51)明顯增多(p<0.05),MM血清組成骨細(xì)胞數(shù)目與正常培養(yǎng)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)4周后,行VonKossa's鈣染色,可見(jiàn)MM患者加入硼替佐米培養(yǎng)組(8.83±1.94)的鈣質(zhì)沉積多于MM正常培養(yǎng)組(

6、6.12±1.63)(p<0.05),但仍少于正常對(duì)照組(15.83±2.23)(p<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組成骨細(xì)胞均不表達(dá)CD138、CD45、CD34。MM血清中IL-7水平(2.07±0.71)高于正常對(duì)照組(1.62±0.15)(p<0.05)。MM正常培養(yǎng)組、MM硼替佐米組及正常對(duì)照組均可表達(dá)BMP2mRNA,MM正常培養(yǎng)組BMP2mRNA無(wú)明顯表達(dá)。
　　 結(jié)論:使用骨髓培養(yǎng)法,可于體外培養(yǎng)MM患者成骨細(xì)胞。