實時定量PCR檢測血中金黃色葡萄球菌DNA及快速藥敏試驗的方法學研究.pdf

1、本研究目的是建立實時定量PCR（RQ-PCR）檢測血標本中金黃色葡萄球菌DNA的方法并對臨床標本進行初步檢測，并建立RQ-PCR快速檢測金黃色葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對抗生素敏感性的方法。
在論文第一部分中，選擇金黃色葡萄球菌高度保守的看家基因fem A基因作為靶基因設計引物和TaqMan探針，建立RQ-PCR反應體系，并采用QIAamp（）DNABlood Mini Kit提取基因組DNA。對26份病人血標

2、本和15份模擬血標本進行RQ-PCR檢測。結果顯示特異性好，檢測限為100拷貝/μl（103CFU/ml），靈敏度為99.7％，特異度為94.6％。標準曲線線性關系好，R2在0.9918～0.9997之間。不同濃度的金黃色葡萄球菌樣本檢測的平均準確性為（96.25±2.26）％；批內(nèi)及批間重復性平均變異系數(shù)（CV）分別為（8.06±0.07）％和（10.01±4.40）％。血標本中金黃色葡萄球菌（108～104）DNA平均提取效率為（1

3、11.72±20.72）％，模擬血標本陽性率為100％，臨床血標本陽性率為15.4％，明顯高于血培養(yǎng)。顯示實時定量PCR可用于定量檢測全血標本中金黃色葡萄球菌DNA的含量。
論文第二部分，對32例外科發(fā)熱患者的84份血標本進行了RQ-PCR檢測。27個標本檢測到金黃色葡萄球菌DNA，陽性率為32.14％，含量約4.36×103～6.39×104CFU/ml，所有患者的血培養(yǎng)結果均為金黃色葡萄球菌陰性。
第三部

4、分，在含有相同濃度金黃色葡萄球菌的LB培養(yǎng)基和血中，加入不同的抗生素，并設立生長對照，培養(yǎng)1、2、4、6和8小時后提取標本的基因組DNA，以金黃色葡萄球菌特異的fem A基因的引物和TaqMan探針對標本進行實時定量PCR檢測。培養(yǎng)過程中，耐藥組與生長對照組的金黃色葡萄球菌DNA拷貝數(shù)均呈對數(shù)增長，在LB液體培養(yǎng)基中增長約2.14～22.82倍，在新鮮全血中增長約2.20～11.69倍；敏感組金黃色葡萄球菌DNA拷貝數(shù)呈持平或減少趨勢，