多抗原表位的串聯(lián)對恒定鏈載體介導的增強免疫應答的影響.pdf

1、主要組織相容性復合體，又稱主要組織相容性復合基因，呈現(xiàn)高度多態(tài)性，主要包含一群緊密連鎖的基因群，且定位在動物或人的某對染色體的特定區(qū)域，其編碼的分子可參與抗原遞呈，制約著細胞之間的相互識別及誘導免疫應答。MHC分子分為三類，包括MHCⅠ、MHCⅡ和MHCⅢ，其中MHCⅡ位于如巨噬細胞一類的抗原提呈細胞上，可呈遞外源性抗原，當細菌侵入組織中，巨噬細胞首先會識別并進行吞噬，再利用MHC分子將細菌的碎片提呈至CD4+T淋巴細胞，誘導產(chǎn)生輔助性

2、T細胞免疫。作為MHCⅡ類分子的主要結構組成部分，γ鏈與α、β鏈在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚合形成一種九聚體(αβγ)3，不同于多態(tài)性的α、β鏈，γ鏈呈非多態(tài)性，因而又被命名為恒定鏈(Invariant chain, Ii)。Ii具有增強免疫、定向運輸抗原肽等作用，臨床上還用于腫瘤的治療。
　　抗原表位也稱為抗原決定簇，是指能夠被抗體或T淋巴細胞受體識別的抗原某些特定存在的區(qū)域。能被抗體識別的表位為B淋巴細胞抗原表位，能被TCR/MHC復合體

3、識別的為T淋巴細胞抗原表位。表位疫苗的優(yōu)勢在于既無需分離傳染性病原體，又能夠減少不同優(yōu)勢抗原表位之間的相互干擾。
　　為了探究Ii功能片段在不同源病毒表位串聯(lián)嵌合體的增強免疫作用，以及改變不同源病毒表位的排列順序?qū)ζ涿庖咴缘挠绊?，本實驗根?jù)NDV HN蛋白與IBDV VP2蛋白的抗原特性及抗原表位的預測分析，以Ii功能片段作為免疫載體，選取NDV-HN（172-201AA）與IBDV-VP2（197-209AA）作為目的片段，并

4、進行串聯(lián)，同時以Ii的Cyt/TM功能片段為載體，以探究多抗原表位串聯(lián)在Ii功能片段增強免疫作用中的特點。
　　首先，通過登錄GenBank數(shù)據(jù)庫分別獲得小鼠Ii（No.NM_001042605），IBDV-VP2（No.AY444873）以及NDV-HN（No.AY510092）序列號，利用Primer Premier5.0軟件設計實驗所需引物，以實驗室保存質(zhì)粒為模板,使用重疊延伸PCR法克隆目的片段NDV-HN（90bp）、C

5、yt/TM/HN（339bp）、HN/VP2（141bp）、Cyt/TM/HN/VP2（390bp）、IBDV-VP2（39bp）、Cyt/TM/VP2（288bp）及Cyt/TM/VP2/HN（390bp），將上述基因片段分別定向插入原核表達載體pET-32a，其中NDV-HN（90bp）與HN/VP2（141bp）還需定向插入原核表達載體pGEX-4T-1用于表達ELISA實驗中的包被抗原蛋白。經(jīng)測序結果鑒定各重組質(zhì)粒已經(jīng)功構建。<

6、br>　　其次，分別誘導表達各個不同種類的融合蛋白。誘導表達的條件經(jīng)過時間與誘導劑的優(yōu)化后方可進行大量表達。將大量表達的菌體反復凍融，同時通過超聲波的裂解處理，最后提取到的各個融合蛋白，使用改良的KCl染色切膠法純化所需目的蛋白。再經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結果表明各個重組質(zhì)粒pET-32a-Cyt/TM/VP2、 pET-32a-Cyt/TM/HN、 pET-32a-Cyt/TM/HN/VP2、pET-32a-Cyt/TM/V

7、P2/HN、pET-32a-VP2、pET-32a-HN、pET-32a-HN/VP2、pGEX-4T-1-VP2及pGEX-4T-1-HN均正確表達，分子量分別為30.6 kDa、32.4 kDa、34.6 kDa、34.6 kDa、21.4 kDa、23.3 kDa、25.2 kDa、27.4 kDa及29.3 kDa，與期待結果一致。
　　最后，將上述獲得的融合蛋白經(jīng)Western Blot法成功鑒定免疫原性，并使用上述得到

8、的His標簽純化融合蛋白分別免疫6～8周齡昆明系SPF級雌性小鼠，設7組實驗組與一組對照組，每組4只。經(jīng)三次免疫后眼球采血，分離血清并檢測抗體。采用間接ELISA法檢測各組血清效價。將獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，所有免疫組小鼠都產(chǎn)生相應抗體，并且其效價高于0.8~1.0*104；而所有用Ii功能片段Cyt/TM作為載體的融合蛋白免疫組小鼠產(chǎn)生的抗體效價，均高于用單一抗原肽免疫的小鼠的約3.1至3.5倍，差異極顯著（p<0.01）。進一步分析

9、發(fā)現(xiàn)，兩種不同抗原肽在連接Ii載體時，其排列順序盡管不同，免疫小鼠產(chǎn)生的特異性的效價幾乎沒有差異(p>0.05)。說明在不同抗原表位串聯(lián)嵌合體中單獨的抗原表位順序?qū)ζ涿庖咴詻]有影響。
　　綜上所述，本實驗成功克隆7個基因片段并分別成功插入原核載體pET-32a與pGEX-4T-1，構建所需的9個重組質(zhì)粒，經(jīng)大量表達與純化后獲得目的蛋白，鑒定其具有免疫原性后免疫小鼠，分析各組血清效價數(shù)值得出結論：1，Ii功能片段Cyt/TM既可以