茶樹(shù)genome survey信息的gSSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其初步應(yīng)用.pdf

1、SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記是以1-6個(gè)堿基為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列的新型DNA指紋標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性好、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，具有其他分子標(biāo)記無(wú)可比擬的優(yōu)越性。近年來(lái)，有關(guān)茶樹(shù)的SSR分子標(biāo)記的報(bào)道也有很多，但主要是基于 EST序列而開(kāi)發(fā)的EST-SSR，與基因組SSR(gSSR)相比，其主要不足是多態(tài)性較低，在遺傳圖譜構(gòu)建時(shí)，難以均勻地覆蓋整個(gè)基因組。因此，急需加大茶樹(shù)gSSR分子

2、標(biāo)記的發(fā)掘與應(yīng)用。本研究以鐵觀音品種全基因組調(diào)查（genome survey）獲得的DNA序列信息為基礎(chǔ)，進(jìn)行g(shù)SSR及其側(cè)翼序列預(yù)測(cè)；建立了基于4300 DNA遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的方法，并利用該方法對(duì)來(lái)自安徽的部分品系（種）進(jìn)行遺傳多樣性分析，檢測(cè)了部分gSSR在雜交和回交1代中的遺傳分布。所取得的主要結(jié)果如下：
　　（1）依據(jù)鐵觀音茶樹(shù)品種genome survey測(cè)序結(jié)果，經(jīng)生物信息預(yù)測(cè)獲得45310個(gè)SSR，其

3、中，二核苷酸重復(fù)最多占75.29％，最多的堿基重復(fù)是AT；其次為占17.55%的三核苷酸重復(fù)，最多的堿基重復(fù)是TTA。
　?。?）應(yīng)用單因素試驗(yàn)和L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了基于4300 DNA遺傳分析系統(tǒng)的SSR-PCR反應(yīng)體系。同時(shí)，證明了可以以自行配制的聚丙烯酰胺凝膠溶液（acry:bis為29：1，濃度為6.5%）替代該系統(tǒng)指定用膠。
　?。?）從預(yù)測(cè)的gSSR中挑選99條序列進(jìn)行SSR-PCR

4、，其中有63條擴(kuò)增成功。利用18個(gè)安徽地方茶樹(shù)品系（種）、4個(gè)國(guó)家級(jí)品種和1個(gè)日本數(shù)苝種，對(duì)22個(gè)gSSR進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果共檢測(cè)出95個(gè)等位位點(diǎn)和158種基因型；每對(duì)引物可檢測(cè)到的等位位點(diǎn)數(shù)和基因型數(shù)分別為2-6個(gè)和2-12種；平均等位位點(diǎn)數(shù)、平均基因型數(shù)和PIC值分別為4.1、6.9與0.53；這些結(jié)果提示所檢測(cè)的SSR具有豐富的位點(diǎn)多態(tài)性。同時(shí)，我們分析了23個(gè)茶樹(shù)品種的遺傳多樣性。結(jié)果得到觀測(cè)雜合度（Ho）為0.05-0.87

5、，平均為0.45；期望雜合度（He）為0.13-0.77，平均為0.6；Nei指數(shù)(H)的范圍在0.13-0.75之間變動(dòng)，平均值為0.58；Shannon信息指數(shù)（I）在0.25-1.49內(nèi)，其平均值為1.1；遺傳相似系數(shù)在0.55-0.78之間。結(jié)果表明所檢測(cè)的茶樹(shù)樣品在DNA分子水平具有豐富的遺傳多樣性。
　　（4） UPGMA法（非加權(quán)組平均法）聚類(lèi)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在遺傳相似系數(shù)為0.65時(shí)，可以把23個(gè)供試品系（種）分為四

6、個(gè)大類(lèi)。第一類(lèi)與第二類(lèi)分別僅包括云抗10號(hào)和豬耳種；第三類(lèi)包括黃山種、楊樹(shù)林種、鐵觀音、福鼎大白茶；第四類(lèi)包括余下的17個(gè)品系（種）。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)為0.67為閾值時(shí)，又可將第四類(lèi)（5）劃分為三個(gè)亞類(lèi)。第一亞類(lèi)包括舒茶早、仙寓早、黃觀音、祁門(mén)櫧葉種和安徽1號(hào)，第二亞類(lèi)僅為橫脈種，余下11個(gè)品系（種）歸為第三亞類(lèi)。
　　（6）以8對(duì)具有多態(tài)性的gSSR引物對(duì)茶樹(shù)雜交1代單株和回交1代單株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雜交1代中，共顯型個(gè)體百