基于EST數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組測序的茶樹DNA分子標記開發(fā)與應用研究.pdf

1、茶樹(Camellia sinensis)是遺傳研究和基因組信息比較缺乏的物種。目前,茶樹上可有效利用的標記數(shù)量非常有限。本研究不僅以現(xiàn)有的公共EST數(shù)據(jù)庫為基礎進行茶樹SSR和SNP分子標記開發(fā)應用研究,而且通過高通量RNA—seq獲得大量茶樹花的轉(zhuǎn)錄組序列,并以這轉(zhuǎn)錄組序列為基礎進行茶樹SSR分子標記的大規(guī)模發(fā)掘,主要研究結果如下:
　　 (1)對NCBI網(wǎng)上公開的12,757條茶樹ESTs序列進行聚類,成功構建了茶樹的獨立

2、基因(Unigene)數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)茶樹的EST序列冗余率約為68.2％,明確了茶樹EST—SSRs的分布特征,設計了206對SSR引物,篩選出多態(tài)性SSR引物59對。
　　 (2)利用開發(fā)的SSR引物對茶樹地方品種的遺傳多樣性取樣策略和西湖龍井群體的遺傳分化進行了研究,發(fā)現(xiàn)平均等位位點Na是最合適的遺傳多樣性取樣參數(shù),當用平均等位位點Na做參數(shù),SSR引物等位位點數(shù)為5時,24個以上單株才能達到總體90％以上的遺傳變異:龍井群體

3、具有較高的遺傳多樣性水平,平均多態(tài)信息含量PIC為0.4382,中度多態(tài)位點占62.5％,高度多態(tài)位點占33.3％。哈迪-溫伯格平衡檢驗表明,66.7％的SSR位點不符合哈迪-溫伯格平衡。分子方差分析表明,西湖龍井五個居群間的遺傳分化程度較低。
　　 (3)初步建立了茶樹EST-SNP開發(fā)體系,明確了茶樹EST中SNP的分布規(guī)律,茶樹編碼區(qū)的SNP發(fā)生頻率約為0.58％,平均200bp就有一個SNP位點,并進一步推算出茶樹基因組

4、DNA序列的雜合率約為0.38％,平均300個堿基就可能出現(xiàn)一個雜合位點。從237個多基因聚類簇中發(fā)現(xiàn)了818個SNP候選位點,設計了25對SNP引物進行DNA測序驗證,發(fā)現(xiàn)EST—SNP候選位點的多態(tài)檢出率為75％。
　　 (4)應用新一代高通量測序技術對茶樹花進行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得茶樹花的轉(zhuǎn)錄組信息75,331條,平均序列長度為402bp,平均測序深度為23.45,平均測序覆蓋度為0.895。通過基因表達水平RPKM值分布分析

5、,發(fā)現(xiàn)茶樹花的轉(zhuǎn)錄組以中低表達豐度的基因為主。經(jīng)過和蛋白數(shù)據(jù)庫NR、Swiss—Prot、KEGG和COG四個數(shù)據(jù)庫比對,共有50,975條茶樹花轉(zhuǎn)錄組的unigene被注釋。
　　 (5)對茶樹花轉(zhuǎn)錄組表達信息進行大通量SSR位點的發(fā)掘,發(fā)現(xiàn)了含SSRs的序列10,290條,共12,582個SSRs,茶樹花轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)的頻率為16.66％。茶樹轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了340種堿基重復模式,在茶樹花的轉(zhuǎn)錄組序列中共發(fā)現(xiàn)340種堿基重復