殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)植入脈絡(luò)膜上腔防治外傷性aPVR.pdf

1、研究背景：
　　 前部增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(anteriorproliferativevitreoretinopathy，aPVR)是由于玻璃體基底部后緣附著處以前的細(xì)胞增殖，引起周邊部視網(wǎng)膜環(huán)形收縮，向前移位并貼附到睫狀體、虹膜后、瞳孔緣或角膜形成的[1]。1991年新的PVR分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)保留1983年所定的A級(jí)和B級(jí)，取消D級(jí)。C級(jí)病交中，赤道前為CA級(jí)病變，赤道后為CP級(jí)病變，將aPVR歸入到PVR分級(jí)當(dāng)中，并且新標(biāo)準(zhǔn)將增生

2、性膜收縮分為5種類型:1型:局限性收縮。2型:彌漫性收縮。3型:視網(wǎng)膜下增生。以上3型為后部增生性玻璃體枧網(wǎng)膜病變.4型:環(huán)形收縮，表現(xiàn)為玻璃體基底部后緣至赤道部以前環(huán)形收縮，使視網(wǎng)膜被牽拉，造成視網(wǎng)膜形成皺褶。5型:前移位，多見(jiàn)于玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)后或眼外傷病人。此外，各種級(jí)別PVR可同時(shí)累及一眼，根據(jù)受累的范圍可以用時(shí)鐘鐘點(diǎn)表示，分為CA1～12和CP1～12。相關(guān)研究表明外傷性aPVR膜的成分是無(wú)色素和含色素睫狀上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素

3、上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、角鞏膜或脈絡(luò)膜的纖維及基質(zhì)細(xì)胞、晶體囊膜或皮質(zhì)等成分，可伴有炎癥細(xì)胞[2,3,4]。近期文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與視網(wǎng)膜是否受損傷[5]以及外傷性PVR[6,7,8]密切相關(guān)，Muller細(xì)胞能夠有效的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜對(duì)外傷的應(yīng)答[7,8,9,10]，此外，還能夠調(diào)節(jié)脫離的視網(wǎng)膜對(duì)機(jī)體的反應(yīng)[11,12]。
　　 目前對(duì)aPVR的研究包括aPVR的分級(jí)、發(fā)病機(jī)制、診斷手段、手術(shù)方式等，尚無(wú)關(guān)于外傷性aPVR的防治

4、的報(bào)道。激素能夠抑制組織的增殖，但是由于血眼屏障的阻礙作用使藥物不容易到達(dá)眼內(nèi)，玻璃體注射雖然能夠使藥物直接作用于眼內(nèi)，效果良好，但是由于藥物半衰期偏短需要反復(fù)注射，增加了眼內(nèi)感染的機(jī)會(huì)而使其應(yīng)用受到一定的限制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用殼聚糖作為藥物載體，載藥后置于眼內(nèi)緩慢釋放，持續(xù)發(fā)揮作用，避免了眼內(nèi)多次給藥所帶來(lái)的安全問(wèn)題[13]。由于脈絡(luò)膜上腔位于脈絡(luò)膜與鞏膜之間，殼聚糖載藥后植入脈絡(luò)膜上腔，避免了鞏膜阻礙藥物吸收，可以使藥物直接作用于周邊視網(wǎng)

5、膜、睫狀體等眼內(nèi)病變組織，抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖，通過(guò)藥物緩慢釋放，持續(xù)發(fā)揮作用抑制aPVR形成，并且其藥物作用濃度大大超過(guò)通過(guò)其它途徑給藥。
　　 目的：
　　 1、探索GICS-TA植入脈絡(luò)膜上腔防治外傷性aPVR的有效性;
　　 2、比較殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)植入脈絡(luò)膜上腔與玻璃體腔注射曲安奈德防治外傷性前部增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的療效;
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)前選取45只健康青紫藍(lán)兔，雌雄不

6、限，體重2.0～2.5Kg，由武漢動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，按照隨機(jī)數(shù)表法依次分入A，B，C、D、E五組，A組、B組、C組、D組每組10只青紫藍(lán)兔，E組5只青紫藍(lán)兔，術(shù)前一周使用裂隙燈、眼底鏡檢查眼前、后節(jié)，并測(cè)量眼壓，排除眼部疾患。手術(shù)當(dāng)天，左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼4次，術(shù)前20min用復(fù)方托品酰胺滴眼2次，間隔5min，散大瞳孔。E組為正常對(duì)照組，不予手術(shù)，其它組予以3％戊巴比妥納1ml/kg耳緣靜脈注射，A，B，C，D組青紫藍(lán)兔將其麻醉成功后

7、，綁在手術(shù)臺(tái)上，氯霉素沖洗左眼，術(shù)眼消毒鋪巾，開(kāi)瞼器開(kāi)左眼瞼，兔眼上方剪開(kāi)球結(jié)膜和部分筋膜，暴露鞏膜后距角膜緣2.5mm處于10:30～11:30作長(zhǎng)為5mm的鞏膜穿通傷，用11號(hào)手術(shù)尖刀穿刺入約10mm，上下擺動(dòng)約20°損傷睫狀體組織，制成外傷性aPVR模型。A組造模后在鞏膜穿刺口附近垂直切開(kāi)鞏膜，分離鞏膜與睫狀體，形成一空腔，在此空腔塞入3mm*3mm大小空白殼聚糖膜，縫合鞏膜切口;B組用A組同樣方法，放置載藥1mg曲安奈德的殼聚糖

8、;C組造膜后向玻璃體腔注射1mg曲安奈德后縫合鞏膜切口，D組僅造模，造模后縫合鞏膜切口。
　　 實(shí)驗(yàn)完畢后，結(jié)膜囊內(nèi)涂妥布霉素眼膏預(yù)防感染。術(shù)后2周，5周，8周使用UBM、裂隙燈分別觀察各組睫狀體增厚程度、有無(wú)增殖膜形成，并觀察各組兔眼前節(jié)炎癥反應(yīng)分級(jí)。術(shù)后8周處死動(dòng)物，標(biāo)記后摘除眼球，冠狀位將眼球一分為二，將其中1/2立即放入放入AGFD眼球固定液，固定一周后，將原固定液液倒出一半，再加等量丙酮繼續(xù)固定5天。5天后取6點(diǎn)位眼球

9、標(biāo)本，經(jīng)乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯及透明石蠟包埋，然后作組織切片并行蘇木素和伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察睫狀體組織形態(tài)。將眼球另1/2去除后節(jié)組織，取6點(diǎn)位睫狀體新鮮標(biāo)本，修剪得0.5cm×0.5cm大小的睫狀體標(biāo)本塊（手術(shù)器械4℃預(yù)冷），立即眼球用磷酸緩沖液(pH7.2～7.4)洗凈表面的血液，然后立即放入4％多聚甲醛—2.5％戊二醛混合固定液中固定，過(guò)夜后，1％鋨酸固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片（冠狀位），透射電鏡下觀察。

10、>　　 對(duì)各組兔眼睫狀體厚度的總體均數(shù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。術(shù)后2周、5周和8周睫狀體厚度的數(shù)據(jù)應(yīng)首先檢查其總體均數(shù)是否滿足正態(tài)分布且方差齊同，如滿足上述條件，則采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析(one-wayclassificationANOVA)，如睫狀體厚度的總體均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需采用Bonferroni法進(jìn)一步行多重比較;如睫狀體厚度的總體均數(shù)不滿足

11、方差分析的條件時(shí)，則采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis檢驗(yàn)），比較各組兔眼睫狀體的厚度均數(shù)是否相同，組間的多重比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)。
　　 于手術(shù)后第1，14，28天評(píng)價(jià)各組兔眼眼前節(jié)炎癥反應(yīng)，將兔眼前節(jié)炎癥反應(yīng)分級(jí)均數(shù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)術(shù)后各組兔眼結(jié)膜、角膜、房水和后囊膜情況分級(jí)采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-WallisH檢驗(yàn)）。
　　 結(jié)果：<

12、br>　　 蘇木精-伊紅染色病理學(xué)觀察可見(jiàn)，A組兔眼8周時(shí)睫狀體基質(zhì)水腫，色素上皮結(jié)構(gòu)紊亂，大量灰白色纖維組織增生，并且牽拉睫狀體，牽拉引起周邊視網(wǎng)膜局部脫離，組織結(jié)構(gòu)破壞。B組兔眼8周時(shí)睫狀體輕度水腫，虹膜部分增殖，余結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，另可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。C組兔眼8周時(shí)睫狀體基質(zhì)水腫，基質(zhì)間隙增寬，細(xì)胞排列較整齊，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。D組兔眼8周時(shí)睫狀體基質(zhì)水腫、隆起;色素上皮結(jié)構(gòu)紊亂，牽拉視網(wǎng)膜，組織結(jié)構(gòu)破壞。E組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)睫狀體

13、無(wú)水腫，組織細(xì)胞排列整齊，色素上皮完整。
　　 透射電鏡觀察顯示，A組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)線粒體腫脹，周圍可見(jiàn)部分空泡狀變性，線粒體周圍有少量色素顆粒;B組兔眼8周時(shí)細(xì)胞核形態(tài)大致正常，可見(jiàn)核仁位于核內(nèi)，還可見(jiàn)部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，有少量色素顆粒分布于周圍。C組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)深染，核周有部分色素顆粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，有分泌顆粒產(chǎn)生。D組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫，呈空泡狀變性，另可見(jiàn)少許色素顆粒。E組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)線粒體形

14、態(tài)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)未見(jiàn)異常，其周可見(jiàn)色素顆粒。
　　 各組兔眼8周時(shí)6點(diǎn)位UBM圖像顯示:A組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)虹膜及睫狀體水腫增厚，厚度達(dá)2.0428mm，邊界不清，相互粘連，牽拉，其間可見(jiàn)低回聲區(qū)。B組兔眼8周時(shí)可見(jiàn)睫狀體及虹膜輕度增厚，睫狀體后隱約可見(jiàn)一與睫狀體平行的條狀物。C組兔眼8周可見(jiàn)睫狀體增殖明顯，虹膜可見(jiàn)增生物粘連，其后可見(jiàn)致密的條狀物與睫狀體粘連。D組兔眼可見(jiàn)虹膜及睫狀體水腫增厚，厚度為2.0356，其間可見(jiàn)低回聲

15、信號(hào)，其后隱約可見(jiàn)條形回聲信號(hào)。E組兔眼可見(jiàn)虹膜向前呈弓狀隆起，睫狀突與虹膜部分相連，虹膜與睫狀突之間可見(jiàn)一較大間隙。使用UBM觀察術(shù)后2周、5周、8周各組兔眼睫狀體的厚度可知不同時(shí)段睫狀體厚度:D組＞C組＞B組＞E組，而A組與D組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明脈絡(luò)膜上腔植入殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥曲安奈德）和玻璃體注射曲安奈德都能夠有效防治睫狀體組織增殖，但睫狀體的厚度相比，B組小于C組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明脈絡(luò)膜上腔植入殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥

16、曲安奈德）比玻璃體注射曲安奈德防治睫狀體組織增殖的效果更好，而空白殼聚糖對(duì)防治前部增生性玻璃體視網(wǎng)膜無(wú)明顯作用。
　　 手術(shù)后28天裂隙燈觀察:A組兔眼結(jié)膜中度睫狀充血，范圍較大，色澤較紅，角膜斑片狀水腫，后彈力層明顯皺褶，厚度增加，房水中度混濁，Tyndall現(xiàn)象(++)，明顯纖維素性滲出，晶體混濁明顯，眼底窺視不清;B組兔眼結(jié)膜輕度睫狀充血，范圍較局限，角膜線狀混濁水腫，較少后彈力層皺褶，房水輕度混濁，Tyndall現(xiàn)象(+

17、)，較少纖維素滲出，后囊膜中度混濁，眼底部分模糊不清;C組兔眼結(jié)膜輕度睫狀充血，范圍較局限，角膜線狀混濁水腫，后彈力層皺褶明顯，房水輕度混濁，Tyndall現(xiàn)象(+)，部分纖維素滲出，后囊膜中度混濁，眼底部分模糊不清;D組兔眼結(jié)膜中度睫狀充血，范圍較大，色澤較紅，角膜斑片狀水腫，后彈力層明顯皺褶，厚度增加，房水中度混濁，Tyndall現(xiàn)象(++)，可見(jiàn)大量纖維素性滲出，晶體混濁明顯，眼底窺視不清;E組兔眼結(jié)膜無(wú)充血，角膜清晰透明，房水清

18、，后囊膜透明。手術(shù)后1天眼前節(jié)炎癥反應(yīng)分級(jí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H統(tǒng)計(jì)量服從x2分布，故以x2值表示檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。x2=39.197，v=4，P=0.000，P＜0.05，五組間有顯著差異性，說(shuō)明各組眼前節(jié)炎癥反應(yīng)分級(jí)有顯著差異，根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，與E組相比較，B組前房炎癥反應(yīng)最輕，C組次之，A組和D組前房炎癥反應(yīng)較重。手術(shù)后1，14，28天眼前節(jié)炎癥反應(yīng)分級(jí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H統(tǒng)計(jì)量服從x2分布，故以x2值表示檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量。五組間有顯著差異性，

19、說(shuō)明各組眼前節(jié)炎癥反應(yīng)分級(jí)有顯著差異，根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，與E組相比較，B組前房炎癥反應(yīng)最清，C組次之，A組和D組前房炎癥反應(yīng)最重。
　　 結(jié)論：
　　 aPVR是眼球穿通傷的嚴(yán)重并發(fā)癥，能夠嚴(yán)重降低眼外傷手術(shù)的成功率，因此尋找一種能減輕眼球穿通傷所致aPVR形成的方法顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥曲安奈德）于脈絡(luò)膜上腔一次性給藥，使用后安全，高效，避免了多次給藥所帶來(lái)的不良反應(yīng)[13]。結(jié)果顯示殼

20、聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥曲安奈德）和玻璃體注射曲安奈德均能夠有效的預(yù)防aPVR的發(fā)生，并且殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)防治前部PVR的效果優(yōu)于玻璃體注射曲安奈德。其作用機(jī)理是:1脈絡(luò)膜上腔位于脈絡(luò)膜與鞏膜之間，殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥曲安奈德）植入脈絡(luò)膜上腔后，使藥物被迅速吸收并且可以持續(xù)的作用于玻璃體和視網(wǎng)膜，從而抑制aPVR的形成。2殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)具有持續(xù)均勻給藥的特點(diǎn)，藥物釋放穩(wěn)定，無(wú)明顯突釋效應(yīng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，持續(xù)地作用于靶目標(biāo)。3脈絡(luò)膜

21、與視網(wǎng)膜緊密貼在一起，藥物直接作用于脈絡(luò)膜，間接作用于視網(wǎng)膜及玻璃體可抑制aPVR形成，而對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用小。
　　 在外傷性aPVR早期，組織炎癥反應(yīng)明顯，可見(jiàn)睫狀體組織增生，以及增值膜覆蓋于睫狀體;晚期可見(jiàn)大量纖維組織增生，出現(xiàn)瘢痕化，增生，增厚;睫狀體組織因受牽拉而變型。UBM是利用高頻超聲檢查眼前節(jié)組織的一種方法[14]，其成像清晰，分辨率高，特別是對(duì)比較隱秘的aPVR有很好的檢出作用。通過(guò)對(duì)2周，5周，8周兔眼睫狀體

22、的厚度測(cè)量發(fā)現(xiàn)B，C，D，E組兔眼睫狀體的厚度均數(shù)各不相同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A組與D組厚度均數(shù)無(wú)明顯差異，說(shuō)明殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥曲安奈德）對(duì)防治兔眼睫狀體的增殖效果最好，其次是玻璃體注射曲安奈德，而空白的殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)對(duì)防治aPVR發(fā)生無(wú)明顯作用。殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)通過(guò)植入脈絡(luò)膜上腔，使藥物迅速持久釋放避免了反復(fù)給藥帶來(lái)的副作用，在臨床上有潛在的使用價(jià)值。殼聚糖緩釋給藥系統(tǒng)（載藥曲安奈德）能夠抑制虹膜，睫狀體等的增殖，防治外傷性