血栓調(diào)節(jié)素-活化蛋白C-內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體系統(tǒng)抗炎癥作用研究進(jìn)展.pdf

1、目的: 通過(guò)建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）凋亡模型，觀察活化蛋白C(APC)的療效及機(jī)制。通過(guò)建立重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠模型，觀察APC治療SAP的療效，進(jìn)而了解蛋白C途徑主要成分表達(dá)水平和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路主要激酶的影響及后續(xù)炎癥介質(zhì)的變化。觀察SAP時(shí)肝臟的血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)以及APC的應(yīng)用對(duì)其的調(diào)節(jié)作用。最終，為今后該藥物的臨床應(yīng)用提供可能的理論依據(jù)。 方法:

2、 1. 將培養(yǎng)成功的HUVECs通過(guò)LPS 1μg/ml誘導(dǎo)凋亡模型，并給予APC （10ng/ml或50ng/ml）設(shè)立治療組及對(duì)照組。通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法觀察細(xì)胞凋亡及增殖變化。另外，同時(shí)測(cè)定相關(guān)凋亡基因的表達(dá)。 2. SD大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組、SAP組、SAP+注射溶媒組、不同劑量APC治療組（10μg/kg, 50μg/kg）。于造模后16小時(shí)取材，觀察各組凝血指標(biāo)（PT、APTT、vWF、D二聚體）水平、

3、胰腺損傷程度（組織學(xué)改變、濕/干重系數(shù)、血清淀粉酶、TNF-α、IL-8、CRP水平）及動(dòng)物生存率等指標(biāo)。 3. SD大鼠隨機(jī)分為： SAP組、不同劑量APC治療組（10μg/kg, 50μg/kg）、對(duì)照組，于造模后16小時(shí)取材。 ①測(cè)定胰腺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9），血栓調(diào)節(jié)素（TM）和內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）mRNA和蛋白表達(dá)。 ②基因芯片篩選胰腺組織MAPKs信號(hào)通路基因表達(dá)，Real-ti

4、me PCR和Western blot驗(yàn)證該通路中胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun N 端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)、p38MAPK mRNA和蛋白的變化。同時(shí)檢測(cè)胰腺組織TNF-α和IL-1β蛋白水平。 ③動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠局部肝血流量（BF）、血容量（BV）、平均通過(guò)時(shí)間（MTT）、毛細(xì)血管表面通透系數(shù)（PS）和肝動(dòng)脈指數(shù)（PAF），24小時(shí)處死動(dòng)物行肝臟和胰腺組織學(xué)觀察。 結(jié)果:

5、 1. LPS組細(xì)胞可見(jiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，而通過(guò)APC治療的細(xì)胞凋亡改變顯著減輕和細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞存活率和PCNA表達(dá)率增高，尤其在50ng/ml時(shí)，與LPS組細(xì)胞比較有顯著差異（P < 0.05）。同時(shí)APC可上調(diào)Bcl-2，降低P53、Bax、Caspase 3的表達(dá)，并在50ng/ml劑量時(shí)與LPS組比較有顯著差異（P < 0.01）。 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果： ①凝血指標(biāo)在不同劑量APC治療組與SAP，SAP+注射溶

6、媒組比較差異均有顯著意義（P < 0.01或0.05），并部分指標(biāo)（PT和D二聚體）在不同劑量APC治療組間有量效關(guān)系（P < 0.01）。同時(shí)不同劑量APC治療組與SAP，SAP+注射溶媒組比較胰腺損傷嚴(yán)重度顯著減輕（P < 0.05），平均生存時(shí)間延長(zhǎng)（P < 0.01）。 ②胰腺組織MMP-9表達(dá)在APC 50μg/kg治療組下調(diào)，而EPCR和TM 表達(dá)上調(diào)（P < 0.01，vs SAP組），同時(shí)TM表達(dá)在不同劑量APC

7、治療組間呈量效性（P < 0.01）。 ③APC50μg/kg治療組與SAP組比較，胰腺組織p38MAPK和JNK/SAPK表達(dá)和活性降低，ERK1/2則增高， TNF-α和IL-1β水平降低（P < 0.01），并且p38MAPK、P-ERK1/2和TNF-α蛋白水平呈現(xiàn)量效關(guān)系（P < 0.01）。 ④SAP組BF，BV降低，MTT延長(zhǎng)，PS增加，PAF下降，以24小時(shí)為顯著。而不同劑量APC治療組與SAP組比較上述

8、指標(biāo)呈相反。尤其APC50μg/kg治療組在16小時(shí)，24小時(shí)上述指標(biāo)差異均有顯著意義(vs SAP組，P < 0.01或0.05)，24小時(shí)肝組織損傷分級(jí)及胰腺損傷評(píng)分明顯較SAP組降低（P < 0.01），與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著意義( P > 0.05)。 結(jié)論: 1. APC通過(guò)調(diào)控相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，拮抗LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡并促進(jìn)增殖，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。 2. APC在SAP病程中除抗凝血作用外

9、，同時(shí)抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而以上述兩種途徑阻斷疾病的進(jìn)展。其作用機(jī)制可能如下： ①APC在SAP病程中可提高TM和EPCR的表達(dá)，能有效強(qiáng)化蛋白C途徑在SAP中的作用而降低胰腺的損傷； ②APC可抑制SAP胰腺組織p38MAPK和JNK/SAPK的表達(dá)和活化，上調(diào)ERK1/2的表達(dá)和活化，進(jìn)而抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)，從而減輕胰腺的損傷； ③APC可改善SAP時(shí)的肝臟血液低灌注狀態(tài)及微循環(huán)障礙，從而減輕