基于去唾液酸糖蛋白受體的循環(huán)肝癌細(xì)胞分離-檢測(cè)系統(tǒng)及其臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者體內(nèi)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumor cells，CTCs)，即循環(huán)肝癌細(xì)胞，是HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。檢測(cè)循環(huán)肝癌細(xì)胞對(duì)于預(yù)測(cè)HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)無(wú)疑具有重要臨床意義。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)HCC患者外周血中甲胎蛋白(alpha-f

2、etoprotein，AFP)mRNA從而檢測(cè)HCC患者CTCs的報(bào)道較多。然而，RT-PCR法有其固有局限，如易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性、操作難以標(biāo)準(zhǔn)化、不能準(zhǔn)確估算樣本中CTC的數(shù)目等。此外，更不可忽視的是，RT-PCR法須破壞細(xì)胞形態(tài)，不能對(duì)單個(gè)CTC進(jìn)行觀察、分析和計(jì)數(shù)，而這些數(shù)據(jù)可提供CTCs惡性程度和侵襲性方面的信息。因此迫切需要建立特異和敏感的循環(huán)肝癌細(xì)胞分離和檢測(cè)技術(shù)。
　　 目前分離CTCs的標(biāo)準(zhǔn)方法是基于腫瘤細(xì)胞表

3、面上皮性抗原的磁性激活細(xì)胞分選技術(shù)(magnetic-activated cell separation，MACS)。由于缺乏針對(duì)肝癌細(xì)胞表面特異性抗原的單克隆抗體，迄今鮮見(jiàn)MACS用于分離循環(huán)肝癌細(xì)胞的報(bào)道。基于上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)抗體磁珠的CellSearch系統(tǒng)己被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于檢測(cè)乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌CTCs。盡管肝癌細(xì)胞屬于上皮性細(xì)胞，但Ep

4、CAM僅在約35％左右的HCC組織標(biāo)本中表達(dá)。因此，CellSearch系統(tǒng)并不適合用于分離、檢測(cè)循環(huán)肝癌細(xì)胞。
　　 去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是一種特異表達(dá)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面的跨膜蛋白，能結(jié)合和內(nèi)吞以半乳糖基和N-乙酰半乳糖胺基為端基的分子。這一特性己被用于設(shè)計(jì)多種實(shí)驗(yàn)研究。比如，利用放射性核素標(biāo)記這樣的糖蛋白，選擇性地與肝細(xì)胞膜上的ASGPR相結(jié)合，可以進(jìn)行肝顯像

5、；而以這樣的糖蛋白為載體將抗腫瘤藥物、降膽固醇藥物、甚至治療基因?qū)蚋螌?shí)質(zhì)細(xì)胞，則是藥物肝靶向遞送的一個(gè)重要研究命題。利用這一個(gè)特性，本課題創(chuàng)建了一種基于ASGPR的磁性分選和肝細(xì)胞特異性抗體Hep Par1免疫鑒定的循環(huán)肝癌細(xì)胞分離/鑒定系統(tǒng)，即以生物素化去唾液酸胎球蛋白作為配體與肝癌細(xì)胞結(jié)合，然后用抗生物素抗體磁珠進(jìn)行間接磁性標(biāo)記，從而磁性捕獲循環(huán)肝癌細(xì)胞，接著用Hep Par1抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于肝

6、細(xì)胞通常不會(huì)脫落進(jìn)入血循環(huán)，除非演變成腫瘤細(xì)胞，因此檢測(cè)到的細(xì)胞即為循環(huán)肝癌細(xì)胞。該系統(tǒng)解決了以前所報(bào)道方法的固有問(wèn)題，具有高度的特異性和敏感性。通過(guò)利用該系統(tǒng)對(duì)HCC患者、良性肝病患者和健康志愿者臨床樣本的檢測(cè)，探討了該系統(tǒng)臨床應(yīng)用的可行性。
　　 方法：
　　 1、采用生物素化試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin和去唾液酸胎球蛋白制備生物素化去唾液酸胎球蛋白，并進(jìn)行離心超濾純化。
　　 2、采用流式細(xì)胞

7、術(shù)驗(yàn)證生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細(xì)胞的結(jié)合活性及確定最佳工作濃度。
　　 3、采用流式細(xì)胞術(shù)分析生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細(xì)胞結(jié)合的特異性。
　　 4、采用生物素化去唾液酸胎球蛋白、抗生物素抗體磁珠進(jìn)行間接磁性標(biāo)記肝癌細(xì)胞，通過(guò)磁場(chǎng)分離肝癌細(xì)胞。
　　 5、采用肝細(xì)胞特異性抗體Hep Par1進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定和計(jì)數(shù)分選到的肝癌細(xì)胞。
　　 6、通過(guò)Hep3B細(xì)胞摻入試驗(yàn)分析所建立的循環(huán)肝癌細(xì)

8、胞分離/檢測(cè)系統(tǒng)的回收率、特異性和敏感性。
　　 7、通過(guò)Hep3B細(xì)胞摻入試驗(yàn)比較基于生物素化去唾液酸胎球蛋白/抗生物素抗體磁珠的循環(huán)肝癌細(xì)胞分離方法與基于EpCAM抗體磁珠的分離方法的回收率。
　　 8、采用所建立的循環(huán)肝癌細(xì)胞分離/檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各種患者5 mL外周血樣本中的CTCs。包括：235例不同分期的HCC患者、20例健康志愿者、37例良性肝病患者(包括16例肝硬化、4例慢性乙型肝炎、6例急性甲型肝炎、8例肝

9、海綿狀血管瘤和3例肝囊腫患者)以及19例其他5種類(lèi)型晚期腫瘤患者(包括3例睪丸癌、4例甲狀腺癌、4例結(jié)腸癌、3例腎癌和5例乳腺癌患者)。
　　 9、采用所建立的循環(huán)肝癌細(xì)胞分離/檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)11例良性肝占位性病變患者(包括8例肝海綿狀血管瘤、3例肝囊腫)手術(shù)切除后第1天、第4天、第7天、第10天和第14天的CTCs。
　　 10、采用CK3-6H5抗體和TUNEL法雙染鑒定HCC患者外周血中凋亡的CTCs。
　　

10、 11、采用CD133抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定HCC患者外周血中具有肝癌干細(xì)胞表型的CTCs。
　　 12、采用Spearman相關(guān)分析、Fisher's確切概率法和Mann-Whitney檢驗(yàn)，分析CTCs陽(yáng)性率以及CTCs數(shù)目與HCC患者臨床特征的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細(xì)胞的反應(yīng)活性好，其最佳工作濃度為0.4 mg/mL。
　　 2、流式細(xì)

11、胞術(shù)結(jié)果顯示，生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細(xì)胞的結(jié)合具有高度特異性。
　　 3、Hep3B細(xì)胞摻入試驗(yàn)顯示，5 mL健康志愿者外周血中分別摻入10、30、90、270和810個(gè)Hep3B細(xì)胞，在每個(gè)摻入水平，Hep3B細(xì)胞的平均回收率均≥61％，并且在只摻入10個(gè)細(xì)胞的所有5個(gè)樣本中，沒(méi)有1個(gè)樣本檢測(cè)到的腫瘤細(xì)胞數(shù)少于5個(gè)。
　　 4、在摻入MCF-7人乳腺癌細(xì)胞和A498人腎癌細(xì)胞的所有標(biāo)本中，均無(wú)細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞

12、檢出。
　　 5、Hep3B細(xì)胞摻入試驗(yàn)顯示，生物素化去唾液酸胎球蛋白/抗體生物素抗體磁珠回收率顯著高于EpCAM抗體磁珠(P＜0.05)。
　　 6、20例健康志愿者、37例良性肝病患者以及19例其他5種類(lèi)型晚期腫瘤病例的5mL外周血樣本中均未檢出CTCs。
　　 7、11例良性肝占位性病變(包括8例肝海綿狀血管瘤、3例肝囊腫)術(shù)前無(wú)1例檢出CTCs，手術(shù)后第1天、第4天、第7天和第10天可檢測(cè)到Hep Par

13、1陽(yáng)性細(xì)胞，且第1天、第4天、第7天和第10天檢出的Hep Par1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次逐漸減少，而第14天則全部病例均檢測(cè)不到CTCs。
　　 8、235例HCC患者中，CTCs陽(yáng)性率為83％(195/235)，CTCs檢出數(shù)范圍0-153個(gè)/5 mL外周血，均數(shù)為21±25個(gè)。
　　 9、部分HCC患者外周血中檢出CD133陽(yáng)性的CTCs。
　　 10、HCC患者的CTCs中有一部分是凋亡的CTCs。
　　

14、 11、統(tǒng)計(jì)分析顯示，在受檢的235例HCC患者中，CTCs陽(yáng)性率和CTCs數(shù)目與腫瘤大小、門(mén)靜脈癌栓、TNM分期、Milan標(biāo)準(zhǔn)符合情況具有顯著相關(guān)性，但與年齡、性別、病因、Child-Pugh分級(jí)和血清AFP濃度均無(wú)相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 本研究創(chuàng)建了一種獨(dú)特的基于ASGPR及其配體相互作用的循環(huán)肝癌細(xì)胞磁性分離方法，結(jié)合基于肝細(xì)胞特異性抗體Hep Par1的免疫熒光染色鑒定方法，形成了一種新穎的循環(huán)肝癌細(xì)胞分