肝臟去唾液酸糖蛋白受體的生物學(xué)特性研究及其特異性適配子的篩選與鑒定.pdf

1、目的：
　　 1. 研究肝臟去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）大亞基異構(gòu)體的產(chǎn)生機(jī)制、表達(dá)水平及其編碼蛋白的特性，為進(jìn)一步闡明ASGPR的生物學(xué)功能及以其為靶標(biāo)的肝臟靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　 2. 篩選獲得能夠特異性高親和力結(jié)合肝臟特異性去唾液酸糖蛋白受體的RNA 適配子，為開發(fā)診斷和治療肝臟疾病的靶向性試劑和藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.從

2、正常人肝組織和HepG2細(xì)胞中克隆ASGPR 大亞基H1的兩種異構(gòu)體H1a和H1b的cDNA 序列，測(cè)序并比對(duì)分析H1b的產(chǎn)生機(jī)制；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常人肝組織和HepG2細(xì)胞中H1a和H1b的表達(dá)比例，以及在HBV、HCV感染情況下和肝癌組織中H1b表達(dá)水平的變化.
　　 2. 合成H1b特異性多肽并與鑰孔戚血藍(lán)素（KLH）偶聯(lián)，免疫小鼠制備H1b特異性多克隆抗體，鑒定抗體的效價(jià)和特異性；親和柱層析的方法從人血清和Hep

3、G2細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離并純化可溶性ASGPR，采用特異性抗體通過Western blot 鑒定可溶性ASGPR的組成；免疫組織化學(xué)檢測(cè)H1b 在肝組織中表達(dá)和定位。
　　 3. 合成一個(gè)長(zhǎng)度為115nt含有25個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA 隨機(jī)文庫(kù)，通過體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建出單鏈RNA 適配子隨機(jī)文庫(kù)，從肝組織中分離純化ASGPR 大亞基作為靶蛋白，采用SELEX（systematic evolution of ligands by expo

4、nential enrichment）技術(shù)篩選高親和力的ASGPR特異性RNA 適配子；測(cè)序分析篩選適配子的序列，預(yù)測(cè)并分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　 4. 同位素32 P標(biāo)記適配子，通過膜結(jié)合測(cè)定實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定篩選適配子對(duì)靶蛋白的特異性和親和力；綠色熒光FITC標(biāo)記適配子，鑒定其與肝細(xì)胞系HepG2和Huh7的特異性結(jié)合。
　　 結(jié)果：
　　 1.人肝組織和肝細(xì)胞系HepG2中普遍表達(dá)ASGPR 大亞基異構(gòu)

5、體H1a和H1b，H1b的cDNA 較H1a 缺失了一段117 nt的序列，該序列是ASGPR 大亞基編碼基因的第二個(gè)外顯子，其兩端具有典型的AG/GT 序列，提示H1的兩種異構(gòu)體產(chǎn)生于對(duì)ASGPR mRNA的選擇性剪接。
　　 2. 正常肝組織和HepG2細(xì)胞中H1a和H1b的表達(dá)比例分別為5.2:1和2.6:1，而且H1b的表達(dá)水平在HBV和HCV感染細(xì)胞中下降約60%，在肝癌組織中下降90%以上。
　　 3. 在從

6、正常人血清和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化的可溶性ASGPR 蛋白中，可以檢測(cè)到H1b 蛋白單體以及H1b和H2 構(gòu)成的多聚體；對(duì)肝組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示H1b不能定位至細(xì)胞膜，而主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 4. 經(jīng)過12 輪SELEX 篩選，適配子文庫(kù)中與靶蛋白結(jié)合的適配子得到明顯富集；對(duì)第12 輪文庫(kù)中隨機(jī)挑選的48個(gè)適配子進(jìn)行測(cè)序并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)文庫(kù)中適配子從結(jié)構(gòu)上主要由兩個(gè)家族構(gòu)成，其占總適配子的比例分別為4

7、5.8%和33.3%；并找到一個(gè)適配子H1-A25與靶蛋白具有很高的親和力，Kd 值為48.79nM。
　　 5、在膜結(jié)合測(cè)定實(shí)驗(yàn)和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系中不添加靶蛋白，或用無(wú)關(guān)蛋白替代靶蛋白，則不能檢測(cè)到明顯的適配子H1-A25和蛋白結(jié)合；而在反應(yīng)體系中加入過量未標(biāo)記適配子H1-A25，則能明顯阻斷放射標(biāo)記適配子H1-A25與H1 蛋白的結(jié)合。
　　 6、FITC標(biāo)記的適配子H1-A25 能結(jié)合至肝癌細(xì)胞系HepG2

8、和HuH-7，但不能結(jié)合不表達(dá)ASGPR的HeLa細(xì)胞；加入ASGPR的多克隆抗體可部分阻斷熒光標(biāo)記適配子H1-A25與HepG2細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞結(jié)合，而加入過量未標(biāo)記適配子H1-A25 則幾乎可以完全阻斷熒光標(biāo)記適配子H1-A25結(jié)合HepG2細(xì)胞的熒光信號(hào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.人肝組織及肝細(xì)胞系HepG2和Huh7中普遍表達(dá)ASGPR 大亞基異構(gòu)體H1a和H1b。
　　 2. 大亞基異構(gòu)體H1b 編

9、碼的蛋白為分泌型H1。
　　 3. 血清中的可溶性ASGPR是由分泌型的H1和H2 構(gòu)成的功能性復(fù)合物。
　　 4. 成功地篩選出了具有高親和力的肝臟ASGPR特異性RNA 適配子H1-A25。
　　 5. 適配子H1-A25 能特異性靶向結(jié)合至肝細(xì)胞。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義：
　　 1. 首次發(fā)現(xiàn)人類肝臟去唾液酸糖蛋白受體大亞基H1 存在剪接異構(gòu)體H1b，并證明此剪接異構(gòu)體編碼的分泌型蛋白