超聲介導(dǎo)攜自殺基因微泡對(duì)卵巢癌細(xì)胞抗瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、卵巢癌是病死率較高的婦科腫瘤，近20年來，盡管在其治療方面取得諸多進(jìn)展，但晚期患者5年生存率一直徘徊在15％-30％。卵巢癌是機(jī)體在各種發(fā)病高危因素下，在基因水平上失去了對(duì)局部組織細(xì)胞生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增生而形成的新生物，其具體發(fā)病原因仍不明確，通常一些學(xué)者認(rèn)為機(jī)體細(xì)胞生長要受原癌基因和抑癌基因的雙重調(diào)控，正常情況下，兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長處于平衡狀態(tài)。抑癌基因功能減弱，或者原癌基因被激活，都會(huì)打破這一平衡，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

2、隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)的發(fā)展，基因治療為卵巢癌患者提供了一種新的治療策略，但目前由于缺乏一種安全、穩(wěn)定、高效的基因轉(zhuǎn)染方法，而極大地限制了基因治療在臨床上的應(yīng)用。新近研究發(fā)現(xiàn)，超聲靶向破壞微泡定位釋放技術(shù)（UTMD）應(yīng)用于基因治療是一種新型的無創(chuàng)性基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。開展UTMD介導(dǎo)目的基因靶向治療的深入研究可望為卵巢癌的基因治療提供一種新型、無創(chuàng)、高效、靶向、安全的新途徑。
　　 本課題首先構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）與HS

3、V1TK共表達(dá)載體；然后分析了超聲微泡介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染卵巢癌的可行性并篩選出合適的超聲參數(shù)：最后，應(yīng)用UTMD技術(shù)將HSV1TK轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后HSV1TK基因在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及自殺基因?qū)β殉舶┘?xì)胞的殺傷效應(yīng)，探討超聲微泡介導(dǎo)自殺基因系統(tǒng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞抗瘤效應(yīng)的機(jī)理，為研究和評(píng)價(jià)UTMD介導(dǎo)的自殺基因轉(zhuǎn)染卵巢癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為卵巢癌基因治療提供一個(gè)新的途徑和手段。本課題研究主要包括以下三個(gè)部分的內(nèi)容：
　　

4、 第一部分增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）與Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV1TK）共表達(dá)載體的構(gòu)建及其在卵巢癌細(xì)胞SKOV3的表達(dá)鑒定
　　 目的：構(gòu)建單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1TK）的真核表達(dá)載體：pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK，鑒定其在真核細(xì)胞中的表達(dá)和功能。
　　 方法：以pORF-HSV1TK為模板，PCR擴(kuò)增的目的基因NHSV1TK片段與pMD18-T載體相連接構(gòu)建重組克隆pMD18.T/H

5、SV1TK。將雙酶切的HSV1TK片段，插入pcDNA3.1-EGFP多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pcDNA3.1-EGFP/HSVITK真核表達(dá)載體并進(jìn)行酶切、測序鑒定。分別用熒光顯微鏡觀察和RT-PCR方法檢測脂質(zhì)體介導(dǎo)pc：BNA3.1-EGFP/HSV1TK在卵巢癌細(xì)胞SKOV3的表達(dá)：分別用MTT法和光鏡檢測胸苷激酶/丙氧鳥苷（HSVlTK/GCV）系統(tǒng)對(duì)SKOV3體外殺傷作用及旁觀者效應(yīng)。
　　 結(jié)果：重組載體酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期

6、結(jié)果一致，基因序列與GENEBANK上報(bào)道的HSV1TK基因序列完全一致。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；RT-PCR結(jié)果表明HSV1TK基因能在SKOV3內(nèi)有效表達(dá)。MTT和光鏡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HSV1TK基因的SKOV3細(xì)胞，加入前體藥物GCV處理后對(duì)其有明顯的殺傷作用和旁觀者效應(yīng)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK，能在SKOV3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，HSV1TK對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV

7、3體外有強(qiáng)大的殺傷作用和旁觀者效應(yīng)。
　　 第二部分超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3的超聲參數(shù)及轉(zhuǎn)染效率研究
　　 目的：探究超聲介導(dǎo)攜Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV1TK）自殺基因微泡轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞的超聲參數(shù)及轉(zhuǎn)染效率。
　　 方法：超聲在不同微泡濃度與輻照時(shí)間（8，15，30，60s間隔1s）組合下輻照SKOV3細(xì)胞，MTT法篩選最適輻照時(shí)間和微泡濃度。將SKOV3分成6組分別進(jìn)行以下處理：超聲

8、輻照組，脂質(zhì)體+超聲輻照組，脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組，微泡+超聲輻照組，陰性對(duì)照組（裸質(zhì)粒），陽性對(duì)照組（脂質(zhì)體），分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK質(zhì)粒后，用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)各組轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行定性和定量檢測，最后采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測HSV1TK基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：MTT檢測在超聲強(qiáng)度0.5 W/cm2，頻率1 MHz，微泡濃度5.6×107個(gè)/ml，輻照時(shí)間8s間隔1s條件

9、下，超聲輻照微泡轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較（P>0.05），超聲輻照微泡對(duì)細(xì)胞活性無明顯抑制。經(jīng)此條件轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下可觀察到脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組的綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；流式細(xì)胞技術(shù)檢測表明，微泡+超聲輻照組轉(zhuǎn)染效率為（11.74±0.19）％，比超聲輻照組（2.19±0.22）％高，而脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組（25.62～0.08）％均高于其他各組（P<0.05）；RT-PCR檢測HSV1TK基因mRNA表達(dá)結(jié)果示，在脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照

10、組的SKOV3細(xì)胞中表達(dá)最高。
　　 結(jié)論：在最適的超聲參數(shù)下，超聲介導(dǎo)微泡不僅能單獨(dú)促進(jìn)HSV1TK基因轉(zhuǎn)染并有效在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)，而且還能夠增強(qiáng)脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。
　　 第三部分超聲微泡介導(dǎo)自殺基因系統(tǒng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞抗瘤效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討超聲微泡介導(dǎo)的自殺基因系統(tǒng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞抗瘤效應(yīng)的機(jī)理。
　　 方法：使用最適的超聲轉(zhuǎn)染參數(shù)，超聲介導(dǎo)微泡將pORF-HSV1TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞

11、后，RT-PCR檢測SKOV3中HSV1TK mRNA的表達(dá)；轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞與不同濃度的前藥丙氧鳥苷（GCV）共培養(yǎng)后，MTT法測定各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖抑制率及在最適GCV濃度下各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的變化情況；光鏡觀察給予GCV后不同組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測各組SKOV3細(xì)胞早期凋亡率及細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果：RT-PCR檢測HSV1TK基因的mRNA在各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均有表達(dá)（陰性對(duì)照組除

12、外），其中在脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組的SKOV3細(xì)胞中表達(dá)最高；MTT檢測到脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組的HSV1TK/GCV在GCV濃度為10.1001μg/ml范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)SKOV3的增殖抑制率明顯強(qiáng)于其它組（P<0.05）；同時(shí)檢測了在GCV（濃度為100μg/ml）作用24-48h內(nèi)，各組細(xì)胞增殖抑制率也顯著增高，并且脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組細(xì)胞增殖抑制率明顯強(qiáng)于其它組（P<0.05）；光鏡下可見脂質(zhì)體+微泡+超聲輻照組經(jīng)HSV1T