超聲介導(dǎo)攜TFO脂質(zhì)超聲微泡對切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 腦血栓形成或腦栓塞是中老年人群的常見疾病之一,其高發(fā)病率及高致殘率嚴(yán)重影響中老年人群的身體健康。預(yù)防腦血栓形成或腦栓塞,對于降低腦血管病的高發(fā)病率或高殘廢率具有重要意義。
　　 近年研究表明,血管壁切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子(TF)高表達(dá)是觸發(fā)血管內(nèi)血栓形成的主要始發(fā)因素之一。干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)對預(yù)防或推遲切應(yīng)力性血栓形成,降低血栓性疾病的發(fā)生有重要意義。本課題設(shè)計合成反向嘌呤寡核苷酸(TFO),后

2、者可阻斷TF基因啟動子區(qū)的切應(yīng)力反應(yīng)元件(SSRE),從而阻斷TF表達(dá),降低切應(yīng)力性血栓的形成。但研究發(fā)現(xiàn)TFO的細(xì)胞吸收率較低,對TF的抑制效率不明顯。目前有研究發(fā)現(xiàn),超聲微泡在超聲作用下可明顯提高基因的轉(zhuǎn)染率,本研究利用超聲微泡技術(shù)聯(lián)合超聲輻照,觀察TFO對TF的作用效率。
　　 本實驗探討通過構(gòu)建攜TFO脂質(zhì)超聲微泡,觀察超聲作用下TFO在內(nèi)皮細(xì)胞和動物頸內(nèi)狹窄處的吸收及TFO對TF的抑制作用,目的是驗證超聲輻照和攜TFO

3、脂質(zhì)超聲微泡的聯(lián)合應(yīng)用對TFO的吸收促進(jìn)作用及對TF的抑制效率。為進(jìn)一步探索將TFO開發(fā)為保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制頸內(nèi)動脈血栓形成新型藥物提供實驗基礎(chǔ),為預(yù)防血栓形成提供新的預(yù)防治療途徑。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建攜帶TFO的脂質(zhì)超聲微泡。普通光鏡下觀察攜TFO脂質(zhì)超聲微泡外觀、形態(tài)。光學(xué)顯微鏡下觀察攜TFO脂質(zhì)超聲微泡的熒光標(biāo)記情況。以Coulter顆粒計數(shù)儀、Zetasizer3000檢測粒徑和粒度分布、表面電位測定。

4、
　　 2.超聲介導(dǎo)攜TFO脂質(zhì)超聲微泡對TFO在內(nèi)皮細(xì)胞的吸收及TFO對TF的抑制作用:將ECV304細(xì)胞隨機(jī)分為4組:空白對照(SSRE)組,僅接受切應(yīng)力作用6h;TFO+超聲輻照(TFO+U)組,取60μlTFO(終濃度0.2μmol/L)加入細(xì)胞,同時給予超聲處理,超聲治療頭頻率1MHz,占空比0.5％,聲強(qiáng)為1W/cm2,輻照作用時間30;TFO-脂質(zhì)微泡(TFO-M)組,,取60μl攜帶TFO脂質(zhì)超聲微泡(終濃度0.

5、2μmol/L)加入細(xì)胞。TFO-脂質(zhì)微泡+超聲輻照(TFO-M+U)組,取60μl攜帶TFO脂質(zhì)超聲微泡(終濃度0.2μmol/L)加入細(xì)胞,同時給予超聲處理,各項參數(shù)同TFO+U組。后三組進(jìn)行TFO轉(zhuǎn)染后24h接受切應(yīng)力(壓強(qiáng)1.2Pa)作用6h。熒光顯微鏡觀察TFO的細(xì)胞吸收率,免疫熒光法和RT-PCR分別檢測TF蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 3.超聲介導(dǎo)TFO脂質(zhì)超聲微泡對切應(yīng)力誘導(dǎo)的大鼠頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞TF抑制作用:將制

6、備的攜TFO超聲微泡臨用前低速離心,用0.9％NaCl稀釋成1.0mg·mL-1混勻,在模型制備前0.5h按0.5mg·kg-1尾靜脈注入。SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對照(SSRE)組:模型制備后6h處死;TFO+超聲輻照(TFO+U)組:注入同等體積0.9％NaCl稀釋成1.0 mg·mL-1混勻的TFO,注射同時,在大鼠頸動脈位置放置超聲探頭進(jìn)行照射,超聲治療頭頻率347KHz,聲強(qiáng)為2.4MPa,輻照作用時間2min;TFO-脂質(zhì)

7、微泡(TFO-M)組:注射攜帶TFO脂質(zhì)超聲微泡;TFO-脂質(zhì)微泡+超聲輻照(TFO-M+U)組:注射攜帶TFO脂質(zhì)超聲微泡,注射同時,在大鼠頸動脈位置放置超聲探頭進(jìn)行照射,各項參數(shù)同TFO+U組。建立頸動脈狹窄動物模型,在不同條件下,免疫熒光法檢測頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞TF蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.成功構(gòu)建攜TFO脂質(zhì)超聲微泡:經(jīng)FITC標(biāo)記的攜TFO脂質(zhì)超聲微泡外觀呈淺黃色混懸液。光鏡下觀察,攜TFO脂質(zhì)超聲微泡均

8、呈圓形,表面光滑,大小均勻,光鏡密集分布,微泡濃度約為7×109/ml左右。熒光顯微鏡下攜TFO脂質(zhì)超聲微泡表面發(fā)出明亮黃綠色熒光;普通脂質(zhì)微泡熒光顯微鏡下不可見。說明微泡脂膜上已成功包載FITC標(biāo)記的TFO。攜帶TFO的脂質(zhì)超聲微泡粒徑分析結(jié)果顯示:IntensityMean:2092.8nm Volume Mean:2114.2nm.Average Mean:2166.9nm?？梢姅y帶TFO的脂質(zhì)超聲微泡平均粒徑為(2.20±0.3

9、5)μm,符合靜脈注射要求。Zeta電位測定結(jié)果為-46.0±1.6mM,說明攜帶TFO的脂質(zhì)超聲微泡為陰離子脂質(zhì)體。
　　 2.超聲介導(dǎo)攜TFO脂質(zhì)超聲微泡對TFO在內(nèi)皮細(xì)胞的吸收及TFO對TF的抑制作用:
　　 1)熒光顯微鏡觀察TFO的細(xì)胞吸收率:轉(zhuǎn)染FITC-TFO的ECV304細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光分布。三組均可見綠色熒光表達(dá)。TFO-M組、TFO+U組陽性細(xì)胞比TFO-M+U組明顯減少。TFO-M組、TFO+U組

10、綠色熒光表達(dá)較弱,主要分布于胞漿。TFO-M+U組可見明亮綠色熒光表達(dá)。圖像分析:TFO-M+U組(38.83±6.52)的轉(zhuǎn)染效率高于TFO-M組(9.50±2.88)和TFO+U組(12.66±3.01)(P＜0.01),后兩組間無顯著差異。
　　 2)免疫熒光法檢測TF蛋白表達(dá):TF蛋白呈現(xiàn)為紅色熒光細(xì)顆粒。SSRE組ECV304細(xì)胞見大量紅色熒光細(xì)顆粒,主要分布在胞漿和胞膜區(qū)域,胞核可見少量紅色熒光細(xì)顆粒。TFO+U組、

11、TFO-M組和TFO-M+U組較SSRE組細(xì)胞紅色熒光量均有不同程度降低;且以TFO-M+U組最為顯著。圖像分析表示:與SSRE組(74.00±16.67)比較,TF蛋白的平均灰度值在TFO+U組(36.83±8.34)、TFO-M組(40.77±9.40)和TFO-M+U組(13.98±6.39)中的表達(dá)降低(P＜0.01);TFO-M+U組較TFO+U組和TFO-M組明顯降低(P＜0.01),后兩組間無顯著差異。
　　 3)

12、 RT-PCR檢測TFmRNA表達(dá):SSRE組可見明顯擴(kuò)增TF條帶;TFO+U組和TFO-M組擴(kuò)增TF條帶較弱;TFO-M+U組擴(kuò)增TF條帶最弱。TFO+U組、TFO-M組和TFO-M+U組的TF和GAPDH的擴(kuò)增帶的密度比值表達(dá)分別為0.36±0.07、0.38±0.07和0.11±0.02與SSRE組(0.71±0.08)相比有所降低(P＜0.01);TFO-M+U組明顯低于TFO+U組和TFO-M組(P＜0.01),后兩組間無顯著

13、差異。
　　 3.超聲介導(dǎo)TFO脂質(zhì)超聲微泡對切應(yīng)力誘導(dǎo)的大鼠頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞TF抑制作用:
　　 成功建立頸動脈狹窄動物模型后,在不同條件下免疫熒光法檢測頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞TF蛋白的表達(dá):SSRE組頸動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目及著色程度顯著;TFO+U組、TFO-M組和TFO-M+U組較SSRE組頸動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF蛋白均有不同程度降低;且以TFO-M+U組最為顯著。圖像分析表明:與SSRE組(71.78

14、±7.10)比較,TF蛋白的平均灰度值在TFO+U組(51.22±5.69)、TFO-M組(55.22±6.47)和TFO-M+U組(20.59±4.38)中的表達(dá)降低(P＜0.01);TFO-M+U組較TFO+U組和TFO-M組明顯降低(P＜0.01),后兩組間無顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.構(gòu)建的攜TFO脂質(zhì)超聲微泡造影劑表面帶負(fù)電荷,粒徑大小符合靜脈注射要求,以脂質(zhì)超聲微泡為載體攜帶TFO是可行的,并成功制備

15、了攜TFO脂質(zhì)超聲微泡造影劑。
　　 2.體外實驗以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304細(xì)胞作為研究對象進(jìn)一步證實:TF表達(dá)下降與。TFO在細(xì)胞內(nèi)的增加相關(guān),TFO的轉(zhuǎn)染率越高,則TF表達(dá)越低,說明TFO可以有效抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá),而脂質(zhì)超聲微泡聯(lián)合超聲輻照可以顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞對TFO的吸收率,從而促進(jìn)TFO對TF的抑制作用。
　　 3.動物實驗以頸動脈狹窄動物模型作為研究對象進(jìn)一步證實:TFO可抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)