益母草提取物抑制凝血酶誘導人臍靜脈內皮細胞組織因子表達機制的研究.pdf

1、組織因子（tissue factor，TF），又稱凝血因子Ⅲ（clotting factor III，F(xiàn)III）或CD142，是一種特異性結合凝血因子 VII（FVII）和活化凝血因子VII（FVIIa）的細胞膜糖蛋白。凝血系統(tǒng)的激活主要依賴于TF的釋放及其啟動的外源性凝血途徑。凝血系統(tǒng)激活是冠心病、缺血性腦血管病、肺栓塞和深靜脈血栓等一系列血栓性疾病的重要病理過程。因此抑制TF表達，進而阻止凝血系統(tǒng)活化，是有效防治血栓性疾病重要策略。

2、目前臨床上尚缺乏直接抑制 TF的藥物。祖國醫(yī)學中的某些中藥具有活血化瘀等抗凝血的功效。初步研究表明，益母草（Leonurus heterophyllus sweet，LHS）能有效地抑制凝血過程，因此我們認為，研究益母草的抗凝血機制是很有價值的。有學者認為，LHS能夠有效抑制凝血酶誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中TF的表達，然而其機制尚不清楚。本論文在

3、發(fā)現(xiàn)益母草能夠有效抑制凝血酶誘導HUVECs TF表達的基礎上，對其可能的信號轉導機制進行了探討。
　　【目的】
　　研究中草藥益母草（LHS）提取物抑制凝血酶（thrombin，Thr）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）組織因子（TF）表達的信號轉導機制。
　　【方法】
　　萃取法制備（LHS）的水提取物，分離和鑒定 HUVECs。應用 MTT比色法分別確定凝血酶的最適作用終濃度為5 NIH U/ml，LH

4、S提取物的作用終濃度分別為1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml。將HUVECs隨機分為對照組（只加入等體積的培養(yǎng)基）、Thr處理組（培養(yǎng)基中加入Thr，終濃度為5 NIH U/ml）和四組LHS提取物處理組（各組培養(yǎng)基均加入終濃度為5 NIH U/ml的凝血酶，同時分別加入終濃度為1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml的益母草提取物），37℃孵育6小時后收集各組HUVECs。應用Northe

5、rn blot檢測TFmRNA的表達，應用一期凝血法檢測TF的促凝活性（TF procoagulant activity，TF:C），應用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測TF抗原（TF antigen， TF:Ag）的含量，采用流式細胞學方法檢測活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylat

6、ed p38 mitogen-activated protein kinase， phospho-p38 MAPK）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酰磷酸化（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶-4、核因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）和蛋白酶激活受體-1（proteinase-activated receptor-1，PAR-1）等信

7、號轉導分子的表達。
　　【結果】
　　HUVECs經(jīng)過Thr處理后，TF mRNA的轉錄以及TF:C和TF:Ag的表達均比對照組明顯增強（與對照組相比，P<0.01）。經(jīng)過LHS提取物處理后，TF mRNA的轉錄以及TF:C和TF:Ag的表達均比Thr處理組顯著減弱（與Thr處理組相比，P<0.01），而且與LHS提取物的劑量呈依賴關系。另外，流式細胞學檢測表明Thr處理組HUVECs細胞中的ROS、phospho-p38

8、MAPK、NADPH氧化酶-4、NF-κB以及PAR-1等信號轉導分子的表達明顯增強（與對照組相比，P<0.01），而各LHS提取物處理組HUVECs中的上述各種信號轉導分子的表達較Thr處理組呈不同程度的減弱（與Thr處理組相比，P<0.01），并與LHS提取物的劑量呈依賴關系。
　　【結論】
　　LHS可能通過抑制 PAR-1和NADPH氧化酶的激活進而減少凝血酶作用于HUVECs過程中的ROS生成，并通過阻斷p38-M