Sox2、Pax6對(duì)ErbB家族基因調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞特性之間既有相同也有不同，其生物學(xué)行為都受到類似的內(nèi)在基因調(diào)控和外在局部微環(huán)境的雙重影響。轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子及其受體是這種雙重調(diào)控的兩個(gè)重要方面，研究它們之間的相互關(guān)系、并比較這種調(diào)控機(jī)制在正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞之間的異同具有重要意義。表皮生長(zhǎng)因子受體（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）是正常神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程所必須的生長(zhǎng)因子；它屬于ErbB基因家族，有四個(gè)成員ErbB

2、1（EGFR）、ErbB2（HER2）、ErbB3和ErbB4，EGFR和ErbB家族的其它成員不僅在干細(xì)胞中有表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中也也具有多種重要的生物學(xué)作用，但調(diào)控ErbB受體家族的轉(zhuǎn)錄因子仍然有許多未知，它們的表達(dá)調(diào)控機(jī)制在干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞中又有哪些相同點(diǎn)和不同點(diǎn)也不清楚。本文將就調(diào)控ErbB家族受體的轉(zhuǎn)錄因子以及它們?cè)谡８杉?xì)胞與腫瘤干細(xì)胞之間的異同進(jìn)行初步的研究。
　　根據(jù)我們的前期工作，有兩類轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)ErbB家族

3、受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要的作用。第一個(gè)是Sox基因（SRYrelated HMG-Boxgenes）家族，Sox基因是一類與干細(xì)胞的特性與細(xì)胞分化非常重要的轉(zhuǎn)錄因子。Sox2是干細(xì)胞的特異標(biāo)志，參與干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)和多項(xiàng)分化潛能的維持。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，Sox2能夠通過調(diào)節(jié)EGFR的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響神經(jīng)干細(xì)胞的自我復(fù)制和增殖，因此，我們提出以下問題：（1）在腫瘤干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞及其他類型的干細(xì)胞中是否也存在Sox2調(diào)節(jié)EGFR的機(jī)制

4、？（2）Sox2對(duì)ErbB家族各成員之間是否均存在類似的調(diào)控關(guān)系？第二個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是Pax6（pairedbox6），Pax6是調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它和EGF-應(yīng)答的神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育可能有直接的關(guān)系，那么，Pax6和EGF以及EGFR之間有什么調(diào)節(jié)關(guān)系呢？如果有，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的又起什么樣的作用呢？進(jìn)一步，在腫瘤干細(xì)胞，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展過程中，是否也存在類似的機(jī)制呢？
　　論文將分為兩部分，

5、第一部分：Sox2對(duì)ErbB家族基因調(diào)控機(jī)制的研究；第二部分：Pax6對(duì)EGFR基因調(diào)控機(jī)制的研究。下面也將分成兩部分論述。
　　第一部分：Sox2對(duì)ErbB家族基因調(diào)控機(jī)制的研究
　　方法：體外包裝Sox2表達(dá)質(zhì)粒和重組腺病毒，以空載腺病毒和Sox10表達(dá)腺病毒為對(duì)照，轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞系、神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）：利用Real-TimePCR方法檢測(cè)ErbB基因家族各成員（EGFR、Erb

6、B2、ErbB3、ErbB4）、及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD133，和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志（S100b、p75NTR、nestin、GFAP、olig2）等基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化；免疫熒光（Immunocytochemistry）和Western-blot分析蛋白表達(dá)水平的變化；雙報(bào)告基因檢測(cè)方法測(cè)定Sox2對(duì)ErbB家族基因的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染Sox2過表達(dá)腺病毒到MCF-7細(xì)胞系中，ErbB2和ErbB3的mRNA轉(zhuǎn)錄

7、水平明顯增加，CD133-mRNA轉(zhuǎn)錄也有增加趨勢(shì)，EGFR和ErbB4的mRNA轉(zhuǎn)錄未見明顯變化；在U87細(xì)胞系和MSC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sox2過表達(dá)腺病毒后，EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、CD133、S100b、p75NTR、nestin、GFAP、olig2等基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平均未見到顯著變化；Immunocytochemistry觀察：在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sox2過表達(dá)腺病毒，Sox2可分別與ErbB2和ErbB3

8、出現(xiàn)共表達(dá)，Sox2蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，而ErbB2和ErbB3蛋白的表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜，胞漿中少量表達(dá)，此外，在新增殖的MCF-7細(xì)胞中，ErbB2和ErbB3也有表達(dá)；Westernblot分析：盡管在MCF-7細(xì)胞中Sox2和ErbB2都有本底水平的表達(dá)，但隨Sox2表達(dá)增加，ErbB2的表達(dá)也明顯增加，而轉(zhuǎn)染空載腺病毒組和Sox10腺病毒組未見到這一變化；報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析：Sox2上調(diào)ErbB2、ErbB3基因啟動(dòng)子區(qū)介導(dǎo)

9、的熒光素酶表達(dá)活性，并且這種表達(dá)隨Sox2質(zhì)粒濃度的增加而增強(qiáng)。
　　結(jié)論：在ErbB2和ErbB3基因啟動(dòng)子區(qū)存在Sox2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)；Sox2可能直接上調(diào)MCF-7細(xì)胞中ErbB2、ErbB3受體的表達(dá)。
　　第二部分：Pax6對(duì)EGFR基因調(diào)控機(jī)制的研究
　　方法：（1）利用Pax6基因突變小鼠做為動(dòng)物模型，解剖取出野生型（WT）和Pax6基因突變型（mutant）胎鼠的背側(cè)皮層，在體外做神經(jīng)干細(xì)胞克隆成球培養(yǎng)

10、。用96孔板法進(jìn)行克隆成球率實(shí)驗(yàn)，并比較兩種神經(jīng)球的EGFR的蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化。（2）利用表達(dá)EGFR的腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，觀察其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的突起生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果：（1）利用Pax6基因突變小鼠做為動(dòng)物模型，研究發(fā)現(xiàn)：野生型（WT）和Pax6基因突變型（mutant）神經(jīng)干細(xì)胞克隆球在大小形態(tài)上無(wú)明顯差異，但Pax6基因突變型小鼠神經(jīng)球克隆數(shù)比野生型小鼠少，EGFR-mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，蛋白表達(dá)降低；（2）