SOX2在乳腺癌轉(zhuǎn)移和血管新生中調(diào)控及機(jī)制的研究.pdf

1、乳腺癌是在女性患者中發(fā)病率排名第一的惡性腫瘤，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30％。據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，在北京、天津、上海等大城市里，乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，同時其發(fā)病率是逐年上升的。前列腺癌是一種在歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)常見的惡性腫瘤，死亡率列在第二位，在發(fā)展中國家的發(fā)病率也呈逐年遞增的趨勢。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是評估腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，同時由轉(zhuǎn)移引發(fā)的腫瘤患者的死亡占所有死亡病例的90％。腫瘤轉(zhuǎn)移是由多個步驟依次發(fā)生而引發(fā)的綜合性結(jié)果，其

2、中包括一些腫瘤細(xì)胞獲得從原發(fā)灶散布到初始轉(zhuǎn)移位置的能力、浸潤到周圍正常的組織以及轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端的轉(zhuǎn)移組織或者器官等。其中，任何一個過程的失敗都會影響整個轉(zhuǎn)移的過程。因為腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要病因，所以如果能更清楚的了解腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的潛在的分子機(jī)制將有助于找到有效治療腫瘤的靶點，為臨床有效防治腫瘤的轉(zhuǎn)移以及提高患者的預(yù)后提供可能。
　　血管生成在腫瘤的發(fā)生中起到了重要的作用，也是伴隨腫瘤轉(zhuǎn)移的一個必要的過程。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，腫

3、瘤的新生血管系統(tǒng)是腫瘤細(xì)胞通過招募骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells(EPCs) from the bone marrow)而形成的。近年的研究表明腫瘤可能是起源于一小部分腫瘤起始細(xì)胞，這樣的小部分細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞特性，同時具有多向分化、自我更新等胚胎干細(xì)胞的特征。SOX(sry-related high-mobility-group box-containing)基因家族是一類具有HMG特征

4、性結(jié)構(gòu)的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，它最早是由Gubbay等在Y染色體缺失小鼠中發(fā)現(xiàn)的。其中轉(zhuǎn)錄因子SOX2是SOX基因家族的一個重要成員。近年許多研究表明SOX2與腫瘤的發(fā)生以及腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控密不可分。一些研究表明，在許多腫瘤組織中證實SOX2具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，然而其潛在的分子機(jī)制尚有待深入探討。
　　為了明確SOX2在腫瘤病因中所起到的作用，利用體內(nèi)體外一系列實驗方法，研究SOX2與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系，進(jìn)而研究了SOX2參與

5、腫瘤轉(zhuǎn)移及新生血管生成調(diào)控的分子機(jī)制，為探討更好的臨床治療腫瘤新靶點提供了理論基礎(chǔ)。
　　首先利用免疫組織化學(xué)染色的方法對乳腺癌組織中的SOX2進(jìn)行檢測，明確SOX2在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展中的作用;其次利用體外實驗進(jìn)一步證實SOX2對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性的影響并進(jìn)一步探討了潛在的分子機(jī)制，其中包括運(yùn)用劃痕實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移能力、利用ELISA和蛋白印跡以及免疫熒光等實驗方法檢測了SOX2過表達(dá)或低表達(dá)腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)移

6、相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子的分泌水平的變化;然后運(yùn)用雙熒光報告系統(tǒng)和CHIP方法證明SOX2對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式;最后利用小鼠原位接種及轉(zhuǎn)移模型對其調(diào)控作用進(jìn)行了體內(nèi)實驗的驗證。
　　另外，在BAL/C小鼠的乳腺癌細(xì)胞株4T1中建立沉默SOX2的穩(wěn)定細(xì)胞系，并在體內(nèi)成瘤，建立荷瘤小鼠模型，取小鼠腫瘤組織進(jìn)行切片制作，通過免疫熒光方法染色檢測沉默SOX2之后腫瘤組織中的CD31和LYVE的表達(dá)變化。
　　利用小鼠骨髓移植的方法，將

7、帶有紅色熒光的小鼠的骨髓細(xì)胞移植給經(jīng)過放射線照射并被破壞造血系統(tǒng)的正常C57小鼠體內(nèi)，并使其造血系統(tǒng)重建。再利用荷瘤小鼠模型，給小鼠接種帶有綠色熒光的EO771細(xì)胞，這樣收取腫瘤組織做熒光染色分析可以發(fā)現(xiàn)腫瘤的新生血管系統(tǒng)的來源，即來源于宿主骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，還是來源于腫瘤細(xì)胞的自分化。
　　通過對50例正常乳腺或癌旁組織和269例腫瘤組織中SOX2的表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)SOX2對乳腺癌的發(fā)生有促進(jìn)作用，乳腺癌組織中SOX2的表達(dá)水

8、平與其臨床分期和病理分級呈正相關(guān)。
　　通過對66例正常淋巴組織和49例乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的SOX2表達(dá)的免疫組化染色檢測及統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SOX2在有乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中明顯高表達(dá)。
　　通過利用劃痕實驗和tranwell細(xì)胞侵襲實驗對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞系DU145的運(yùn)動能力檢測，我們發(fā)現(xiàn)SOX2對細(xì)胞的遷移和侵襲能力有明顯的促進(jìn)作用。
　　利用沉默SOX2的MCF-7細(xì)胞和分別過表達(dá)S

9、OX2的MCF-7和DU145細(xì)胞，通過對EMT相關(guān)標(biāo)志物E-鈣粘蛋白和α-肌動蛋白在腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)SOX2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程。
　　通過ELISA檢測前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞上清中TGF-β1和TGF-β2的分泌水平，以及在這兩種腫瘤細(xì)胞中檢測其它TGF-β通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)SOX2對EMT的調(diào)控不是通過TGF-β通路進(jìn)行的。
　　SOX2是通過與WNT/β-catenin信號通路的經(jīng)典途徑對E

10、MT產(chǎn)生作用，主要目的基因是β-catenin。并且是通過直接結(jié)合到β-catenin啟動子序列的方式對其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。并且能影響WNT/β-catenin信號通路相關(guān)基因DKK3、DVL1和DVL3的表達(dá)。
　　SOX2對腫瘤細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移作用不僅僅體現(xiàn)在體外實驗中，同樣也發(fā)生在小鼠乳腺癌原位荷瘤模型中。
　　SOX2可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對腫瘤微環(huán)境中骨骼來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的招募作用促進(jìn)腫瘤的血管新成過程。
　　SOX2促

11、進(jìn)腫瘤細(xì)胞中CD31、LYVE和VEGF的高表達(dá)，說明腫瘤組織SOX2基因不僅能夠修飾腫瘤微環(huán)境，而且同時促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞共同參與腫瘤新生血管的生成。
　　通過以上實驗，得到主要結(jié)論如下:
　　SOX2與乳腺癌的發(fā)生、臨床指標(biāo)特別是轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。
　　SOX2能通過調(diào)控WNT/β-catenin信號通路對腫瘤細(xì)胞的EMT過程起到促進(jìn)作用。
　　SOX2能通過直接結(jié)合于β-catenin啟動子序列