BMP-2調(diào)控EMT促進(jìn)伴微鈣化乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、目的：鉬靶 X線上微鈣化表現(xiàn)，經(jīng)常是提示腫瘤惡性的征象，然而具體機制不詳。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是TGF-β超家族的重要成員之一，可促進(jìn)骨、軟骨生成，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，及調(diào)節(jié)多種臟器生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)BMPs與異位鈣化密切相關(guān)，且BMP-2在多種腫瘤有異常表達(dá)。本文旨在研究BMP-2在伴微鈣化乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征、預(yù)后之間的關(guān)系，探究其對乳腺癌的影響及調(diào)控機制

2、。
　　方法：
　　1.收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院529例伴微鈣化病例，分析微鈣化與患者臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。并從中選取100例患者，切蠟塊進(jìn)行免疫組化分析，了解其中BMP-2、Runx2、OPN的表達(dá)情況，分析BMP-2與預(yù)后的關(guān)系。
　　2.體外實驗驗證 BMP-2與乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系。選出低表達(dá) BMP-2的細(xì)胞系 MCF-7，以及高表達(dá) BMP-2的細(xì)胞系 MBA-MD-231，分別通過加rhBMP

3、-2刺激BMP-2表達(dá)，以及加入BMP-2抑制劑Noggin來抑制BMP-2的表達(dá)，應(yīng)用 MTT檢測 BMP-2對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用平板克隆實驗檢測BMP-2對細(xì)胞克隆形成能力的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測BMP-2對細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用劃痕試驗和Transwell實驗檢測BMP-2對侵襲遷徙能力的影響。
　　3.我們對BMP-2調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制進(jìn)行研究，首先利用real-time PCR和Western blot等

4、技術(shù)分析細(xì)胞系中BMP-2與EMT相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控EMT的可能，為探究其調(diào)控EMT的可能機制，我們應(yīng)用real-time PCR和Western blot等技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞系驗證BMP-2與PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的關(guān)系。以及加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，BMP-2對EMT的調(diào)控是否受到抑制來進(jìn)一步驗證其可能的作用通路。
　　4.建乳腺癌移植瘤模型，觀察BMP-2對移植瘤的生長、轉(zhuǎn)移等情況的影響，

5、并應(yīng)用real-time PCR技術(shù)和免疫組化方法檢測移植瘤中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：1.伴微鈣化乳腺癌患者腫瘤較大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，并且無進(jìn)展生存相對較差，伴微鈣化為影響預(yù)后的獨立因素之一。在伴微鈣化乳腺癌組織中， BMP-2、Runx2、OPN表達(dá)明顯增高，提示三者可能參與微鈣化形成，異位骨形成可能為微鈣化形成的機制之一。BMP-2高表達(dá)與患者無進(jìn)展生存明顯相關(guān)，為獨立預(yù)后因素之一。
　　2.外源性rhBMP-2可促

6、進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中BMP-2的表達(dá)。而BMP-2抑制劑Noggin可以抑制MBA-MD-231細(xì)胞中BMP-2表達(dá)。體外實驗結(jié)果顯示， rhBMP-2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成以及遷移侵襲能力，并且可使凋亡能力下降。而Noggin可抑制BMP-2的作用，從而抑制腫瘤增殖、克隆形成，抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力，并且可以促進(jìn)凋亡。提示BMP-2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞惡性程度。
　　3.在乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中，BMP-2的表達(dá)

7、與 EMT一些指標(biāo)顯著相關(guān)。隨著BMP-2濃度增加，上皮表型 E-cadherin、Cx43表達(dá)顯著下調(diào)，而間質(zhì)表型N-cadherin、FN、Vimentin mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。BMP-2可促進(jìn)PI3K/Akt信號通路p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控EMT進(jìn)程。而加入此信號通路抑制劑 LY294002后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR未出現(xiàn)明顯的上調(diào)，EMT相關(guān)指標(biāo)無明顯改變，BMP-2調(diào)控EMT的

8、作用明顯減弱?？梢夿MP-2可以通過激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT，從而誘導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.應(yīng)用經(jīng)BMP-2處理過的乳腺癌MCF-7細(xì)胞成功建立BMP-2高表達(dá)移植瘤模型。BMP-2組移植瘤增長速度明顯快于對照組。BMP-2組出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及骨轉(zhuǎn)移的比例明顯大于對照組。與對照組相比，BMP-2組E-cadherin表達(dá)減弱， Vimentin表達(dá)增強，提示出現(xiàn)EMT現(xiàn)象。體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證BMP

9、-2可促進(jìn)EMT進(jìn)程，調(diào)控乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺癌伴微鈣化這一特征與腫瘤惡性度密切相關(guān)。
　　2. BMP-2高表達(dá)于伴微鈣化乳腺癌中，且與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是預(yù)后不良的指標(biāo)。
　　3.經(jīng)BMP-2刺激后乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移能力增強，惡性度提高。
　　4. BMP-2可誘導(dǎo)PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白磷酸化，調(diào)控EMT相關(guān)指標(biāo)變化，誘導(dǎo)EMT進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　5.體內(nèi)實驗證實 BM