眼發(fā)育關(guān)鍵基因PAX6真核表達(dá)載體構(gòu)建以及PAX6-mESCs細(xì)胞系的建立.pdf

1、目的：構(gòu)建眼發(fā)育關(guān)鍵基因PAX6的真核表達(dá)載體，初步探究其在真核細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而將PAX6基因轉(zhuǎn)染入小鼠（m）ESCs并獲得PAX6/mESCs穩(wěn)株，為進(jìn)一步探討利用PAX6誘導(dǎo)ESCs定向分化為LSCs的可能性奠定基礎(chǔ)，以期為角膜損傷提供種子細(xì)胞。
　　方法:
　　1.利用基因克隆技術(shù)獲得PAX6基因并將其定向插入真核表達(dá)載體pEF1α-IRES-AcGFP中，獲得重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP，脂質(zhì)體

2、轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中GFP的表達(dá)、蛋白印跡法檢測PAX6蛋白表達(dá)。
　　2.胰蛋白酶消化法獲得MEFs并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，繪制各代細(xì)胞生長曲線；用抗α微管蛋白加抗生物素蛋白-Cy5、抗鬼筆環(huán)肽-FITC、碘化丙啶（PI）分別對細(xì)胞的微管、微絲及染色體進(jìn)行免疫熒光染色，對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架分析；選擇第3代MEFs用于制備飼養(yǎng)層，用三個(gè)不同濃度絲裂霉素 C（10μg/ml、20μg/ml和30μ

3、g/ml）分別處理MEFs1、2、3小時(shí)，MTT法篩選最佳處理?xiàng)l件；接種C57BL/6-mESCs于飼養(yǎng)層中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　3.穩(wěn)定傳代后的mESCs按0-800μg/ml8個(gè)濃度G418進(jìn)行篩選獲得最佳篩選濃度；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)立未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染24h后用200μg/ml G418結(jié)合GFP熒光進(jìn)行篩選，100μg/ml G418維持培養(yǎng)，最終獲得PAX6穩(wěn)

4、定表達(dá)的細(xì)胞株P(guān)AX6/mESCs；對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行PAX6、GFP免疫熒光染色鑒定，Western-blot檢測PAX6蛋白在mESCs內(nèi)表達(dá)；AP染色鑒定轉(zhuǎn)染后mESCs細(xì)胞干性。
　　結(jié)果：
　　1. pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP經(jīng)PCR和SalI/BamHI雙酶切均得到大小為1269bp的條帶，測序鑒定該序列與GenBank中PAX6基因序列的同源性達(dá)100％，插入基因的大小和方向正確；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染結(jié)果

5、顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組293FT細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示PAX6蛋白表達(dá)。
　　2.胰酶消化法成功分離昆明小鼠MEFs，生長曲線結(jié)果顯示P3-5細(xì)胞增殖能力較好；細(xì)胞骨架免疫熒光染色結(jié)果顯示第1-3代細(xì)胞微管微絲排列整齊，5代以后的細(xì)胞微管微絲排列紊亂；10μg/ml絲裂霉素C處理2小時(shí)的飼養(yǎng)層細(xì)胞利于mESCs細(xì)胞的培養(yǎng)；
　　3.200μg/ml G418為mESCs最佳篩選濃度；對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用

6、200μg/ml G418結(jié)合GFP熒光進(jìn)行篩選，獲得PAX6穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株P(guān)AX6/mESCs；PAX6/mESCs細(xì)胞內(nèi)有GFP、PAX6熒光表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示在PAX6/mESCs中有PAX6蛋白表達(dá)，AP染色呈陽性。
　　結(jié)論：成功構(gòu)pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP并可在293FT細(xì)胞中的表達(dá)；成功制備飼養(yǎng)層MEFs用于mESCs培養(yǎng)；成功獲得PAX6/mESCs穩(wěn)株，且PAX6/mESCs