花背蟾蜍Pax6 variant蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)特性及功能的初步研究.pdf

1、Pax6是眼發(fā)育過(guò)程中一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它包括兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域(配對(duì)區(qū)和同源區(qū))和一個(gè)脯氨酸/絲氨酸/蘇氨酸(PST)富集區(qū)。Pax6基因?qū)棺祫?dòng)物眼的結(jié)構(gòu)發(fā)育和嗅覺(jué)細(xì)胞的分化都是必需的。Pax6基因有多種突變體，如人類的Pax6突變可導(dǎo)致多種表型突變，包括無(wú)虹膜，Peter's異常，常染色體顯性角膜炎，以及家族性的視網(wǎng)膜中央凹發(fā)育異常。目前檢測(cè)到的人類Pax6基因PST區(qū)的突變就有12種，其中10種都為截?cái)嗤蛔儭?br>　　

2、 本實(shí)驗(yàn)以花背蟾蜍鰓血循環(huán)期胚胎為材料，用RT-PCR法成功克隆得到了花背蟾蜍Pax6 variant基因開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)全序列基因，連接至pMD18-T克隆載體上后，酶切并克隆至pET-28a表達(dá)載體，測(cè)序后得到構(gòu)建正確的原核表達(dá)載體。將正確的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)表達(dá)宿主菌中，經(jīng)過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化后，得到最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度20℃，IPTG濃度0.5 mM。在該條件下大量誘

3、導(dǎo)表達(dá)His-Pax6 variant融合蛋白，經(jīng)His親和層析柱純化后，得到融合蛋白His-Pax6 variant。檢測(cè)蛋白純度及濃度后，以該蛋白為抗原，免疫昆明品系小鼠制備多克隆抗血清。并利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay； ELISA)檢測(cè)抗血清效價(jià)，達(dá)到一定濃度后，眼球取血獲得小鼠抗花背蟾蜍多克隆抗血清。
　　 利用免疫親和層析法純化多克隆抗血清，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

4、檢測(cè)抗體靈敏性，并用Western Blot法檢測(cè)抗體的特異性。實(shí)驗(yàn)表明純化后的抗體具有較高特異性。并用3D-PSSM軟件對(duì)花背蟾蜍Pax6野生型蛋白和Pax6 variant蛋白進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明Pax6野生型蛋白和Pax6 variant蛋白具有相似的螺旋/折疊結(jié)構(gòu)比。在Pax6野生型蛋白中，含有3％的β-折疊和25％的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，而在Pax6 variant蛋白中，則含有5％的β-折疊和20％的α-螺旋。在PST區(qū)P