不同強度絕對不應(yīng)期電刺激對心力衰竭兔心臟功能影響的實驗研究.pdf

1、心力衰竭(heart failure，HF)是導(dǎo)致死亡的重要危險因素，而且能增加病人住院治療日，降低生活質(zhì)量，提高治療費用。最近二十年，HF的藥物治療方面取得了重大進步，ACEI、β受體阻滯劑、醛固酮拮抗劑在降低HF病人的發(fā)病率和死亡率中有著重要的作用。這些治療延遲了難治性HF的進展，但是不足以阻止疾病的惡化進程，仍需進一步干預(yù)方法。最近幾年，機械裝置為基礎(chǔ)的治療方法出現(xiàn)，像心臟再同步治療、心臟輔助裝置、優(yōu)化系統(tǒng)(Impulse Dyn

2、amics)。心臟收縮調(diào)節(jié)(cardiac contractilitymodulation，CCM)作為機械裝置治療方法進入人們視線，它是在絕對不應(yīng)期內(nèi)給予的非興奮性刺激(Non-Excitatory Currents，NEC)即絕對不應(yīng)期電刺激（absolute refractory period electric stimulation，ARPES），是一種非常有前景的新治療方法，目前已應(yīng)用于治療嚴重HF的Ⅲ期臨床病人。在H人中顯示

3、能提高人的提高運動耐量和生活質(zhì)量，最近研究顯示從心肌組織活檢中發(fā)現(xiàn)，CCM處理能使HF時許多異?；虮磉_正常化，包括參與鈣循環(huán)的蛋白質(zhì)。心臟收縮性調(diào)節(jié)是非藥理學(xué)方法使用電流提高肌絲鈣效應(yīng)，是提高HF心臟收縮功能安全的、可行的方法，有報道認為這種方法無致心律失常作用。
　　 HF是由于心肌疾病或者心臟外因素損害泵功能引起綜合征，表現(xiàn)為心臟功能障礙，盡管心腔充盈充分，心輸出量降低，不能滿足組織器官代謝需求，同時神經(jīng)介質(zhì)激活，在分子水

4、平心肌凋亡和心肌適應(yīng)性改變。交感神經(jīng)系統(tǒng)(SAS)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在調(diào)節(jié)心肌收縮力、調(diào)節(jié)血管反應(yīng)、維持血流灌注等方面發(fā)揮著重要作用。HF時，交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，兒茶酚胺類物質(zhì)如去甲腎上腺素等釋放入血，具有提高心率、正性肌力作用（增加心肌收縮的力量和速度），同時通過收縮組織、腎臟等內(nèi)臟和皮膚血管，增加了前負荷和后負荷。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，腎素活化，增加交感神經(jīng)張力同時，血管緊張素Ⅱ刺激醛固酮加壓素產(chǎn)生

5、，導(dǎo)致心肌纖維化和心室重構(gòu)。
　　 本研究通過檢測去甲腎上腺素(NE)、腎素(Renin)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)，觀察ARPES對SAS、RAAS的影響，探討其改善心臟功能的神經(jīng)內(nèi)分泌機制。
　　 B型利鈉肽(BNP)是診斷早期HF的重要指標，敏感性90％，特異性76％，其表達水平的高低與HF的NYHA心臟功能分級相關(guān)，而且有助于評估HF病人預(yù)后，判斷HF的治療是否需要加強。BNP水平升高是HF非常

6、重要的獨立預(yù)測因子，而且與腎功能無關(guān)，也是60天死亡的非常重要預(yù)測指標。在一項BNP研究中，1586名因呼吸困難急癥入院的病人，HF病人的BNP濃度最高，有非心源性呼吸困難但有心臟功能不全病史病人次之，沒有HF或左室功能不全的病人最低，對鑒別HF有重要的價值。
　　 慢性和亞臨床炎癥是HF的病理基礎(chǔ)，其主要特征就是全身性炎癥反應(yīng)，因此HF并不僅僅是泵衰竭疾病，而是一種全身性疾病。全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)在炎性因子產(chǎn)生、釋放，補體激活以及

7、自身抗體產(chǎn)生，其中細胞炎性因子在HF發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。細胞因子是免疫系統(tǒng)細胞通過神經(jīng)激素激活產(chǎn)生的，其中最重要的兩種是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6(IL-6)。TNF-α引起內(nèi)皮功能障礙，蛋白質(zhì)合成減少，分解增加，導(dǎo)致肌肉分解增加，心肌收縮力下降，同時誘導(dǎo)心肌細胞肥大。有研究表明NYHAⅣ級病人TNF-α、IL-6明顯升高，可直接影響心臟功能，導(dǎo)致嚴重運動能力受限。目前對IL-6通過刺激心肌糖蛋白受體130參與心室肥大

8、有了一定的認識。IL-6與NYHA分級、住院治療時間、左室功能降低相關(guān)，它作為預(yù)測標記物的作用至今仍沒有定論。
　　 縫隙連接（Gap junctions，Gj）形成了細胞與細胞電流精確有序的傳導(dǎo)通路，支配心臟節(jié)律，而其功能與心臟表達connexin43(CX43)、connexin(Cx40)、connexin(Cx45)等縫隙連接蛋白密切相關(guān)?？p隙連接蛋白連接異常主要表現(xiàn)在縫隙連接蛋白的分布異常和數(shù)量、表達類型改變，與HF的

9、病理生理學(xué)有著密切聯(lián)系。縫隙連接蛋白的表異常達和組織重構(gòu)在HF的作用已經(jīng)有報道。在心衰病人和動物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CX43表達降低，縫隙連接分布紊亂，這些特征性變化與心律失常、心臟功能不全相關(guān)。
　　 雷尼丁受體受體（ryanodine receptors，RyRs）本質(zhì)上是一種鈣離子通道。根據(jù)RyRs的分布和生物特性的不同，哺乳類動物RyRs可分為RyR1、RyR2、RyR3，其中RyR2主要在心肌細胞中表達。心肌收縮的強弱決定于R

10、yR2釋放Ca2+的多少。心肌細胞產(chǎn)生動作電位時，二氫吡啶受體（dihydropyridine receptor, DHPR）介導(dǎo)少量細胞外鈣內(nèi)流，RyR2被激活，細胞內(nèi)鈣庫的Ca2+釋放到細胞質(zhì)，引起胞質(zhì)中游離的Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白，啟動心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)。肌漿網(wǎng)RyR2調(diào)控的細胞內(nèi)Ca2+異常與HF、心律失常、心肌梗死等疾病密切相關(guān)。
　　 本研究通過評估ARPES的急性效應(yīng)（左室壓力變化如dP/dt等血流動力

11、學(xué)參數(shù)、心臟功能、心室肌CX43、RyR2、血清BNP表達水平），了解ARPES對HF的影響。綜上所述，本實驗從SAS、RAAS、細胞炎性因子、心肌CX43和RyR2影響心臟功能的角度，探討不同強度ARPES影響心臟功能的機制。
　　 第一部分、不同強度絕對不應(yīng)期電刺激對心力衰竭兔心臟功能的影響
　　 目的：觀察ARPES對HF兔心臟功能指標、血流動力學(xué)指標、血清BNP水平的影響，探討其是否對HF兔心臟功能具有保護作用。

12、
　　 方法：6月齡成年新西蘭大白兔，采用升主動脈縮窄法，1個月后建立兔HF模型。開胸術(shù)前、術(shù)后1個月、ARPES后即刻測量心臟功能及制備血清標本，術(shù)后1個月測量血流動力學(xué)指標。術(shù)中常規(guī)監(jiān)測肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)，ARPES持續(xù)12小時。運用彩色超聲心動圖儀對假手術(shù)組（SHAM組）、心力衰竭組(HF組)、絕對不應(yīng)期電刺激組（ARPES組）三組兔進行圖像采集，二維超聲引導(dǎo)下取左室長軸切面，經(jīng)M超曲線測量舒張末期室間隔厚度(ⅣSd

13、)、舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分數(shù)(EF％)、左室短軸縮短率(FS％)、左心室的舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)，心尖五腔心切面測量主動脈瓣上流速(AV)，心尖四腔心切面觀察二尖瓣反流，測量舒張期二尖瓣口血流速度(MV)。頸動脈途徑法通過MPA2000心臟功能儀測量左室壓最大上升與下降速率(+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin)

14、、左室收縮峰壓(LVSP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)、左室平均壓力（LVPmean）、心率(HR)。采用雙抗體夾心ABC-ELWASA法檢測BNP表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況：術(shù)前SHAM、HF、ARPES三組間比較體重(W)、心率(HR)、呼吸頻率(R)無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后1個月時，HF組、ARPES組HR、R較SHAM顯著升高，P＜0.05，而體重有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。ARPES組

15、、HF組間HR、R、W比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。HF組、ARPES組HR、R較術(shù)前顯著升高，P＜0.05，W無明顯變化，P＞0.05。SHAM組HR、R、W較術(shù)前無差別，P＞0.05。
　　 2.生化指標的改變：術(shù)前三組間生化指標均無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。ARPES組、HF組肝功能指標（ALT、AST）和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH)較SHAM顯著升高，P＜0.05。ARPES組ALT、AST、CK、CK-MB

16、、LDH較HF組有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。三組間比較ALT/AST均無統(tǒng)計學(xué)意義。腎功能指標血清（尿素、肌酐、K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+）三組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。HF組、ARPES組血脂(TG、TC)均較SHAM組顯著下降，P＜0.05，但VLDL及血糖三組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。HF組、ARPES組ALT、AST、CK、CK-MB、LDH較術(shù)前顯著升高，P＜0.05，血脂TG、TC顯著降低，P＜0.05，其他生化

17、指標較術(shù)前無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。SHAM組生化全項較術(shù)前均無差異，P＞0.05。
　　 3.絕對不應(yīng)期電刺激對兔心臟彩超指標的影響：HF組LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV較SHAM組顯著升高，P＜0.01，EF、FS、MV顯著降低，P＜0.05，而LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。ARPES組LVEDD、EDV較HF組有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，LVESD、ESV顯著降低，P＜0.01，EF、FS、AV

18、、MV顯著升高，P＜0.01，但LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。ARPES組LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV較SHAM組顯著升高，P＜0.05，EF、FS、MV顯著降低，P＜0.01，但LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。不同刺激強度（ARPES-L亞組、ARPES-H亞組）對心臟彩超各參數(shù)的影響無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。HF組、ARPES組LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV較術(shù)前顯著升高

19、，P＜0.01，EF、FS、MV顯著降低，P＜0.05，而LVPWd、ⅣSd無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。SHAM組心臟彩超各參數(shù)較術(shù)前無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。
　　 相關(guān)分析：對心臟射血分數(shù)LVEF和LVEDD、LVESD做相關(guān)分析表明EF和LVEDD、LVESD(r=-0.6099，-0.8694)呈負相關(guān)。
　　 4.絕對不應(yīng)期電刺激對兔血流動力學(xué)的影響：ARPES組、HF組LVSP、LVEDP、LVPmean、

20、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin絕對值較SHAM組顯著降低，P＜0.01。ARPES組LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin絕對值較HF組顯著升高，P＜0.01。另外ARPES-H亞組LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin絕對值較ARPES-L亞組有升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。
　　 5.絕對不應(yīng)期電刺激對兔血清BN

21、P表達水平的影響：術(shù)前三組間BNP表達水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。1個月時ARPES組、HF組BNP表達水平較SHAM組顯著升高，P＜0.01，ARPES組較HF組顯著降低。ARPES-H亞組BNP表達水平較ARPES-L亞組無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。ARPES組、HF組BNP表達水平較術(shù)前顯著升高，P＜0.01，SHAM組較術(shù)前無統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05。
　　 結(jié)論：通過升主動脈縮窄法可成功建立兔HF模型，短期ARP

22、ES可增強HF兔心肌收縮力，穩(wěn)定血流動力學(xué)，改善心臟功能。實驗提示ARPES增可強心肌收縮力，降低LVESD，從而改善心臟功能，但不同ARPES刺激強度對HF兔心肌收縮力、改善心臟功能和血流動力學(xué)的影響無差別。
　　 第二部分、不同強度絕對不應(yīng)期電刺激對心力衰竭兔交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用
　　 目的：通過ARPES后NE表達水平，了解其對SAS的影響。通過觀測Renin、AngⅡ、ALD的表達水平

23、，探討ARPES對RAAS的作用。同時觀察低強度、高強度ARPES（ARPES-L、ARPES-H）對SAS、RAAS的影響是否存在差異。
　　 方法：SHAM組、HF組開胸術(shù)前、術(shù)后1個月，ARPES組開胸術(shù)前、ARPES后頸內(nèi)靜脈采血，制備血清標本，采用雙抗體夾心ABC-ELWASA法檢測NE、Renin、AngⅡ、ALD的濃度，觀察SAS和RAAS的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況及生化指標的改變：

24、同第一部分。
　　 2.開胸術(shù)前SHAM組、HF組、ARPES組NE、Renin、AngⅡ、ALD無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。術(shù)后SHAM組、HF組NE、Renin、AngⅡ、ALD較SHAM組顯著升高，P＜0.01，ARPES組NE、Renin、AngⅡ較HF組顯著升高，P＜0.01，但ALD無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。SHAM組、HF組NE、Renin、AngⅡ、ALD較術(shù)前顯著升高，P＜0.01，SHAM組較術(shù)前無統(tǒng)計學(xué)意

25、義。ARPES-L亞組NE、Renin、AngⅡ、ALD較ARPES-H亞組無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。
　　 3.NE與Renin、AngⅡ、ALD相關(guān)分析表明：血清Renin、AngⅡ、ALD含量與NE(0.8642，0.8329，0.6581，P＜0.01)呈正相關(guān)。另外，Renin與AngⅡ(0.8141,P＜0.01)、Renin與ALD(0.6911,P＜0.01)、AngⅡ與ALD(0.6895，P＜0.01)亦呈

26、正相關(guān)。
　　 結(jié)論：HF兔NE分泌增多，SAS激活，Renin、AngⅡ、ALD升高，RAAS系統(tǒng)亦激活，表明SAS、RAAS系統(tǒng)參與了HF的代償機制，同時參與了HF的發(fā)生和發(fā)展。ARPES可以啟動SAS、RAAS的代償機制，可能參與了HF的進展。不同強度ARPES對SAS、RAAS的影響不存在差別。
　　 第三部分、不同強度絕對不應(yīng)期電刺激對心力衰竭兔細胞炎性因子腫瘤壞死因子α、白介素-6的作用
　　 目的：

27、觀察SHAM組、HF組、ARPES組兔血清細胞炎性因子TNF-α、IL-6的表達水平，了解ARPES對細胞炎性因子的作用，探討ARPES是否具有保護心臟的抗炎機制。同時對比不同強度ARPES對細胞因子作用的差異。
　　 方法：頸內(nèi)靜脈法留取血液，制備血清標本，留置血液時間點為SHAM組、HF組、ARPES組三組于術(shù)前，SHAM組、HF組開胸術(shù)后1個月，ARPES組刺激處理后即刻。采用雙抗體夾心ABC-ELWASA法檢測TNF-α

28、、IL-6表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.術(shù)前TNF-α、IL-6表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05，開胸術(shù)后1個月時HF組、ARPES組TNF-α、IL-6表達水平較SHAM組顯著升高，P＜0.01，ARPES組較HF組顯著降低，P＜0.01。HF組、ARPES組TNF-α、IL-6表達水平較術(shù)前顯著升高，P＜0.01，SHAM組較術(shù)前無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。ARPES-H亞組較ARPES-L亞組TNF-α、I

29、L-6表達水平有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。
　　 2.相關(guān)分析：對兔血清細胞炎性因子TNF-α、IL-6表達水平做相關(guān)分析表明給予HF兔ARPES處理后TNF-α與IL-6表達水平(0.8582，P＜0.01)呈正相關(guān)。血清TNF-α表達水平與Renin、AngⅡ、ALD表達水平(r=0.8676，0.7691，0.6986，P＜0.01)，與NE表達水平(r=0.3402，P＞0.05)無相關(guān)關(guān)系。血清IL-6表達水

30、平與NE、Renin、AngⅡ、ALD表達水平(r=0.8004，0.8457，0.8208，0.7299，P＜0.01)呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：細胞炎性因子TNF-α、IL-6在HF時表達上調(diào)，與SAS、RAAS共同參與了HF的發(fā)生和發(fā)展。ARPES可抑制HF后細胞炎癥反應(yīng)，但不同強度ARPES對HF兔的細胞炎性反應(yīng)的作用無顯著差異。ARPES改善心臟功能的作用可能被SAS、RAAS激活而部分抵消。
　　 第四部分、不

31、同強度絕對不應(yīng)期電刺激對心力衰竭兔心肌2型雷尼丁受體、縫隙連接蛋白43的影響
　　 目的：觀察SHAM組、HF組、ARPES組兔RyR2、CX43在心室肌表達水平變化，了解ARPES對心肌細胞興奮、收縮以及興奮收縮偶聯(lián)的影響，從分子水平探討非興奮性刺激的作用機制。
　　 方法：開胸術(shù)后1個月時SHAM組、HF組、ARPES組留取心肌組織，-80℃下冷凍保存。采用熒光定量PCR法檢測左心室心肌組織RyR2、CX43在表達水

32、平。
　　 結(jié)果：
　　 1.開胸術(shù)后1個月時HF組、ARPES組RyR2、CX43表達水平較SHAM組顯著降低，P＜0.01，而ARPES組較HF組顯著升高，P＜0.01。ARPES-L亞組、ARPES-H亞組間RyR2、CX43表達水平比較，無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。
　　 2.相關(guān)分析：對兔心肌組織RyR2、CX43表達水平做相關(guān)性分析表明RyR2與CX43表達水平(r=0.5636，P＜0.01)呈正相

33、關(guān)。對兔心肌組織RyR2、CX43表達水平和EF、LVSP、+LVdP/dtmax做相關(guān)分析，心臟EF、LVSP、+LVdP/dtmax與CX43表達水平(r=0.8350，0.5174，0.7629，P＜0.01)呈正相關(guān)，心臟EF、LVSP、+LVdP/dtmax與RyR2表達水平(r=0.6707，0.5480，0.6745，P＜0.01)亦呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：兔HF后RyR2、CX43表達水平下降，心室肌收縮力及心臟