17β-雌二醇的快速舒血管效應(yīng)及其內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴的作用機(jī)制.pdf

1、目的 本課題采用Myodap血管張力儀進(jìn)行體外血管灌流實(shí)驗(yàn)，測(cè)量雌性SD大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)等長張力，旨在觀察17β-雌二醇(17β-estradiol，E<,2>)的快速舒血管效應(yīng)并探討其內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴性的作用機(jī)制。血管張力改變將導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生，本研究將為闡明雌激素?cái)U(kuò)張血管的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本論文主要包括以下兩個(gè)部分： 第1章 17β-雌二醇的快速舒血管效應(yīng)及其

2、內(nèi)皮依賴性作用機(jī)制 第2章 17β-雌二醇快速舒血管效應(yīng)的非內(nèi)皮依賴性作用機(jī)制 方法 1.離體血管環(huán)的制備和張力測(cè)定雌性SD大鼠斷頸處死，迅速分離胸主動(dòng)脈，放入預(yù)冷的Lrebs液，去除血管上的脂肪及結(jié)締組織，將動(dòng)脈剪成2段長2mm的血管環(huán)，置于10ml含Kerbs液的器官小室中。兩根細(xì)金屬絲分別由血管內(nèi)腔穿過血管環(huán)，并固定于Myodap血管張力儀(丹麥，Danish Myo TechnologyA/S)兩端的肌動(dòng)

3、描記器裝置上，將溫度設(shè)定在37℃，持續(xù)充以95﹪O<,2>和5﹪CO<,2>的混合氣體。調(diào)整血管環(huán)至適當(dāng)?shù)那柏?fù)荷(通過血管張力儀標(biāo)準(zhǔn)化步驟確定)，平衡60～90min，期間每隔20min更換Kebs液一次。實(shí)驗(yàn)血管先用苯腎上腺素(PE，10<'-6>mol/L)鑒別血管收縮活性，一些實(shí)驗(yàn)血管需去除內(nèi)皮，采用不繡鋼絲插入血管腔中輕輕滾動(dòng)完成，用ACh(10<'-5>mol/L)檢測(cè)內(nèi)皮完整性，對(duì)ACh舒張大于70﹪認(rèn)為內(nèi)皮完整，舒張消失則

4、認(rèn)為內(nèi)皮破壞成功。沖洗血管環(huán)再次平衡至基線水平，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2.電子顯微鏡內(nèi)膜完整的主動(dòng)脈血管環(huán)分別用Krebs(對(duì)照)或6mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理60min，4℃固定過夜放在含2﹪戊二醛、2﹪多聚甲醛和蔗糖的0.1mol/L的二甲砷酸鈉鹽溶液中，樣本用0.1mol/L的二甲砷酸鈉鹽溶液沖洗，然后再次固定于4﹪鋨酸中1h，樣本用乙醇脫水、用環(huán)氧樹脂包埋在Epon812，超薄切片用醇制的醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛二重染色，用透射電子

5、顯微鏡觀察內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 1.E<,2>對(duì)預(yù)收縮血管的效應(yīng)及去除內(nèi)皮的影響內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管環(huán)，用PE(10<'-6>mol/L)或高鉀(100mmol/L)預(yù)收縮，約20～30min達(dá)到最大穩(wěn)定狀態(tài)，然后分別加入不同濃度的E<,2>(10<'-9>～1O<'-4>mol/L)。結(jié)果顯示，E<,2>濃度為10<'-9>mol/L時(shí)，沒有觀察到血管舒張，10<'-8>～10<'-6>mol/L時(shí)，E<,2>呈濃度依

6、賴性地舒張血管，約5分鐘起效，40分鐘達(dá)到平衡，去內(nèi)皮的血管環(huán)舒張程度明顯小于內(nèi)皮完整的血管環(huán)；但在E2濃度增高至10<'-5>～10<'-4>mol/L時(shí)，去內(nèi)皮與內(nèi)皮完整的血管環(huán)血管舒張程度無差異(內(nèi)皮完整：(67.18±9.58)﹪，去內(nèi)皮：(57.99±8.57)﹪；n=10；P>0.05)。 2. L-NAME和MB對(duì)E<,2>舒血管作用的影響L-NlAME是一氧化氮合酶(NOS)的抑制劑，MB是鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的

7、抑制劑。內(nèi)皮完整的血管環(huán)用L-NAME(10<'-4>mol/L)或MB(10<'-5>mol/L)孵育20min，然后用PE或高鉀預(yù)收縮，穩(wěn)定后分別加入E<,2>(10<'-6>、10<'-5>mol/L)。結(jié)果表明，L-NAME或MB可以顯著抑制E<,2>(10<'-6>mol/L)的舒血管效應(yīng)；但是L-NAME或MB并不抑制E<,2>(10<'-5>mol/L)的舒血管效應(yīng)；去內(nèi)皮與內(nèi)皮完整用L-NAME或MB孵育的血管環(huán)舒張沒有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3．Tramoxifen對(duì)E2舒血管效應(yīng)的影響為了觀察雌激素受體是否參與介導(dǎo)了雌激素快速舒張血管的作用，內(nèi)皮完整的血管環(huán)，用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑Tamoxiofen(Ta，他莫昔芬，10<'-5>mol/L)孵育30min，用PE預(yù)收縮，加入E<,2>(10<'-6>mol/L)，與對(duì)照組不用Tamoxifen孵育比，觀察到E<,2>舒血管效應(yīng)顯著抑制。 4. 甲基-β-環(huán)糊精對(duì)質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)的影響用透

9、射電子顯微鏡觀察甲基-β-環(huán)糊精對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)膜質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)的影響。與對(duì)照組用Krebs液孵育比較，內(nèi)膜完整的血管環(huán)，甲基-β-環(huán)糊精處理(Mβ CD，6mmol/L，60min)后，質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)顯著被破壞。 5. 甲基-β-環(huán)糊精對(duì)E<,2>舒張血管效應(yīng)的影響內(nèi)膜完整的血管環(huán)，用甲基-β-環(huán)糊精(M β CD，6mmol/L)預(yù)處理60min后，用高鉀預(yù)收縮，穩(wěn)定后加入不同濃度E<,2>(10<'-8>～10<'-5>mol/L

10、)。結(jié)果表明，與對(duì)照組不用MβCD處理相比，E<,2>(10<'-8>～10<'-6>mol/L)誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)顯著被抑制，但是高濃度的E<,2>(10<'-5>．mol/L)誘導(dǎo)的血管舒張效應(yīng)不被抑制。 6.E<,2>對(duì)CaCl<,2>發(fā)縮量效曲線的影響為研究高濃度E<,2>是否主要通過抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流而直接舒張血管平滑肌，在去內(nèi)皮的血管環(huán)，測(cè)量E<,2>對(duì)CaCl<,2>在無鈣高鉀溶液中收縮的影響。去內(nèi)皮的血管環(huán)，用無

11、鈣Krebs溶液沖洗三次(間隔10min)，穩(wěn)定后，換用無鈣高鉀溶液(含1mmol/LEGTA，60mmol/LK<'+>)，無/有E<,2>(10<'-5>、10<'-4>mol/L)孵育30min，累積加入CaCl<,2>(5×10<'-4>、10<'-5>、5×10<'-5>、10<'-2>mol/L)。結(jié)果顯示，在無鈣高鉀溶液中，CaCl<,2>誘導(dǎo)濃度依賴性血管收縮，E<,2>(10<'-5>、10<'-4>mol/L)孵育可

12、抑制CaCl<,2>誘導(dǎo)的血管收縮，使CaCl<,2>收縮量效曲線右移。 結(jié)論 1.雌激素具有快速舒血管效應(yīng)，既有內(nèi)皮依賴性作用機(jī)制，也有非內(nèi)皮依賴性作用機(jī)制，與雌激素作用的濃度有關(guān)。 2.雌激素濃度為10<'-9>mol/L時(shí)，沒有觀察到血管舒張效應(yīng)，濃度為10<'-8>～10<'-6>mol/L時(shí)，雌激素能濃度依賴性的快速舒張血管，作用呈內(nèi)皮依賴性，與雌激素受體介導(dǎo)內(nèi)皮釋放NO有關(guān)，且需要內(nèi)膜質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)完整