大豆疫霉菌分子檢測(cè)技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、大豆疫霉侵染大豆引起的大豆疫霉病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，也是我國(guó)的A1類檢疫對(duì)象。大豆疫霉病原菌的卵孢子主要通過黏附在種子表面以及混雜在種子里的土壤顆粒進(jìn)行傳播，也可通過帶病種子傳播。因此，建立大豆疫霉菌快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法，不僅對(duì)我國(guó)與其他國(guó)家的大豆貿(mào)易至關(guān)重要，而且對(duì)控制大豆疫霉病在我國(guó)的傳播也是必不可少的。 本研究用真菌18S-28S 間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增大豆疫霉菌和其它外群真菌

2、的基因組DNA，并克隆測(cè)序。得到的序列與GenBank中疫霉屬其它種及相關(guān)種的ITS序列比對(duì)，利用DNAMAN軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，并設(shè)計(jì)出了檢測(cè)大豆疫霉菌的特異性引物BJF/R。引物的特異性驗(yàn)證表明該對(duì)引物只能從大豆疫霉中擴(kuò)增得到-650 bp的特意條帶，該對(duì)引物對(duì)大豆疫霉純基因組DNA的靈敏度檢測(cè)可達(dá)到0.1 fg。 本研究根據(jù)大豆疫霉菌與相關(guān)真菌ITS序列差異，設(shè)計(jì)出了對(duì)大豆疫霉具有穩(wěn)定點(diǎn)突變的特異性引物Ps-1，Ps-2

3、 和 TaqMan 探針Ps-Probe。通過優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立了針對(duì)大豆疫霉菌的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。該探針除大豆疫霉菌能檢測(cè)到熒光信號(hào)增強(qiáng)外，其它菌株都無熒光信號(hào)增強(qiáng)；該探針對(duì)大豆疫霉純基因組DNA的靈敏度檢測(cè)可達(dá)到0.01 fg，比常規(guī)PCR高100倍。 本研究根據(jù)大豆疫霉菌可溶性蛋白的特異性，建立了鑒定該菌的SDS—PAGE檢測(cè)方法。根據(jù)GDS—PAGE可以直接鑒定出該菌，為植物檢疫部門提供了一種