RAS-RAF-PI3K信號(hào)通路基因突變及20q擴(kuò)增與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)性研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率在世界惡性腫瘤中排名第三位，肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因之一。多種遺傳學(xué)的改變?cè)诮Y(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，最重要的改變包括RAS-RAF/PI3K通路相關(guān)基因的體細(xì)胞突變和20q染色體擴(kuò)增。RAS-RAF/PI3K通路相關(guān)基因突變不僅提示患者對(duì)抗EGFR的靶向藥物耐藥，而且與臨床病理特征、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。此外，20號(hào)染色體長(zhǎng)臂(20q)顯著擴(kuò)增的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的

2、風(fēng)險(xiǎn)要明顯高于其他患者。
　　上述研究數(shù)據(jù)多數(shù)來源于西方患者，僅有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道過中國人群中RAS-RAF/PI3K通路中KRAS2號(hào)外顯子、BRAF和PIK3CA等頻率較高的基因突變，關(guān)于KRAS3、4號(hào)外顯子和NRAS等頻率較低的基因突變僅見一篇報(bào)道。因此，本研究旨在中國結(jié)直腸癌患者中檢測(cè)RAS-RAF/PI3K通路相關(guān)基因的主要突變區(qū)，包括KRAS外顯子2、3、4，NR4S外顯子2和3、BRAF以及PIK3CA基因，以明確其突

3、變頻率和突變類型的分布。同時(shí)設(shè)計(jì)多個(gè)位于20q的BAC探針，結(jié)合iFISH技術(shù)了解原發(fā)灶中20q的擴(kuò)增狀態(tài)，并將上述數(shù)據(jù)結(jié)合患者的臨床病理特征和隨訪資料進(jìn)行綜合分析。為中國結(jié)直腸癌患者靶向藥物的選擇及肝轉(zhuǎn)移早期診斷提供重要依據(jù)。
　　收集東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院和東南大學(xué)附屬江陰市人民醫(yī)院2007年-2012年共353例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶石蠟標(biāo)本，所有患者均有完整的臨床病理及隨訪資料。提取腫瘤組織基因組DNA，采用PCR-直接測(cè)序的

4、方法檢測(cè)KRAS基因的2、3、4外顯子，NRAS2和3外顯子，BRAF15外顯子和PIK3CA的9、20外顯子，綜合分析所有突變與患者臨床病理、術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生存狀況之間的關(guān)系。獲得主要結(jié)果如下:
　　1.結(jié)直腸癌患者中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的突變頻率依次為52.7％、3.4％、4.5％和13.1％，其中KRAS2號(hào)外顯子之外的RAS基因的突變頻率可達(dá)到14％。
　　2.NRAS突變?cè)谂曰颊咧谐霈F(xiàn)的頻率

5、高于男性患者(75％ vs25％，p=0.019);BRAF突變顯示與不良的原發(fā)灶病理分級(jí)(p=0.003)、高TNM分期(p=0.001)、較深的原發(fā)灶浸潤(rùn)程度(p=0.019)相關(guān);同時(shí)，BRAF突變的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.004)、術(shù)前和術(shù)后轉(zhuǎn)移（術(shù)前轉(zhuǎn)移:p=0.002;術(shù)后轉(zhuǎn)移:p=0.016）的風(fēng)險(xiǎn)增高;PIK3CA基因突變頻率在結(jié)腸癌患者中升高(p=0.014)。
　　3.KRAS2號(hào)外顯子突變患者的平均年齡高

6、于野生型患者（67歲vs64歲，p=0.036），此類患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也顯著高于后者(52.3％ vs41.6％，p=0.046)。KRAS3號(hào)外顯子突變與低TNM分期(p=0.011)、較淺的原發(fā)灶浸潤(rùn)程度(p=0.001)相關(guān)。
　　4.BRAF突變與患者總體生存率降低顯示出強(qiáng)相關(guān)性(p＜0.001)，攜帶PIK3CA和NRAS突變的Ⅰ-Ⅲ期結(jié)直腸癌患者發(fā)生術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加(p=0.033;p=0.017)，

7、并能分別作為提示患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立指標(biāo)（PIK3CA: HR=3.129，p=0.003; NRAS: HR=5.152,p=0.003）。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)挑選出40例未轉(zhuǎn)移和6例肝轉(zhuǎn)移的樣本，并成功進(jìn)行iFISH雜交和探針計(jì)數(shù)。本研究將肝轉(zhuǎn)移患者增加到10例，另增加11例肝外轉(zhuǎn)移的患者。根據(jù)我們?cè)O(shè)計(jì)的3個(gè)20q染色體的BAC克隆探針，結(jié)合iFISH(間期熒光原位雜交)技術(shù)直接檢測(cè)每個(gè)標(biāo)本單個(gè)腫瘤細(xì)胞中20q的擴(kuò)增狀態(tài)。繪制

8、ROC曲線并設(shè)定的臨界值，根據(jù)臨界值分組分析20q擴(kuò)增與患者臨床病理特征、生存及肝轉(zhuǎn)移間的相關(guān)性。獲得主要結(jié)果:在腫瘤腺體中，實(shí)驗(yàn)探針信號(hào)明顯多于參照探針，三個(gè)實(shí)驗(yàn)探針的均值與參照探針之間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。由于三個(gè)實(shí)驗(yàn)探針分別雜交20q的上部、中部和尾部，說明結(jié)直腸癌中20q擴(kuò)增的片段可能橫跨20q12到20qter的區(qū)域，3.20q13.2/20p12探針最適合評(píng)價(jià)腫瘤腺體20q的擴(kuò)增情況。由于樣本量小，尚未發(fā)現(xiàn)2

9、0q擴(kuò)增狀態(tài)與患者臨床病理特征、預(yù)后及肝轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。
　　日前我國開始著手準(zhǔn)備精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃，并已公布第一批腫瘤診斷與治療項(xiàng)目高通量基因測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用試點(diǎn)單位，旨在通過基因?qū)用娓_的指導(dǎo)腫瘤治療和預(yù)測(cè)生存。我們的研究數(shù)據(jù)為預(yù)測(cè)抗EGFR靶向藥物的有效性提供了重要依據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)RAS-RAF/PI3K信號(hào)通路相關(guān)基因的總突變頻率高達(dá)62.3％，說明可能有過半的患者并不能真正從靶向治療中獲益。當(dāng)患者在未進(jìn)行基因檢測(cè)的情